Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 037825

   Библиографические данные
(11)037825    (13) B1
(21)201991913

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2021.05.25
Текущий бюллетень: 2021-05  
Все публикации: 037825  
Реестр евразийского патента: 037825  

(22)2018.02.14
(51) C12N 9/22(2006.01)
(43)A1 2020.01.22 Бюллетень № 01  тит.лист, описание  последовательности 
(45)B1 2021.05.25 Бюллетень № 05  тит.лист, описание  последовательности 
(31)102017000016321
(32)2017.02.14
(33)IT
(86)EP2018/053717
(87)2018/149888 2018.08.23
(71)УНИВЕРСИТА` ДЕЛЬИ СТУДИ ДИ ТРЕНТО (IT)
(72)Черезето Анна, Казини Антонио, Петрис Джанлука, Инга Альберто, Оливьери Микеле (IT)
(73)УНИВЕРСИТА` ДЕЛЬИ СТУДИ ДИ ТРЕНТО (IT)
(74)Медведев В.Н. (RU)
(54)ВЫСОКОТОЧНЫЕ ВАРИАНТЫ Cas9 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
   Формула 
(57) 1. Выделенный модифицированный белок Cas9, содержащий одну или более мутаций, расположенных в одном или более положений аминокислотных остатков, выбранных из K526, K377, E387, D397, R400, D406, A421, L423, R424, Q426, Y430, K442, P449, V452, A456, R457, W464, M465, K468, Е470, T474, P475, W476, F478, K484, S487, A488, T496, F498, L502, N504, K506, Р509, F518, N522, E523, L540, S541, I548, D550, F553, V561, K562, E573, А589, L598, D605, L607, N609, N612, Е617, D618, D628, R629, R635, K637, L651, K652, R654, T657, G658, L666, K673, S675, I679, L680, L683, N690, R691, N692, F693, S701, F704, Q712, G715, Q716, Н723, I724, L727, I733, L738 и Q739, где указанные положения мутаций идентифицируют посредством обращения к нумерации аминокислот в немодифицированном зрелом Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9), как приведено в SEQ ID NO: 1.
2. Модифицированный Cas9 по п.1, который содержит мутацию в положении K526.
3. Модифицированный Cas9 по п.2, в котором мутация в положении K526 представляет собой K526N или K526E.
4. Модифицированный Cas9 по п.3, в котором указанная мутация в положении K526 представляет собой K526E.
5. Модифицированный Cas9 по п.4, который дополнительно содержит одну или более дополнительных мутаций, расположенных в одном или более положений аминокислотных остатков, выбранных из K377, E387, D397, R400, Q402, R403, F405, D406, N407, A421, L423, R424, Q426, Y430, K442, P449, Y450, V452, A456, R457, W464, M465, K468, Е470, T472, I473, T474, P475, W476, F478, K484, S487, A488, M495, T496, N497, F498, L502, N504, K506, Р509, Y515, F518, N522, E523, L540, S541, I548, D550, F553, V561, K562, E573, А589, L598, D605, L607, N609, N612, Е617, D618, D628, R629, R635, K637, L651, K652, R654, T657, G658, W659, R661, L666, K673, S675, I679, L680, L683, N690, R691, N692, F693, Q695, H698, S701, F704, Q712, G715, Q716, Н721, Н723, I724, L727, А728, I733, L738 и Q739, где указанные положения мутаций идентифицируют посредством обращения к нумерации аминокислот в SEQ ID NO: 1.
6. Модифицированный Cas9 по п.4 или 5, в котором указанные одну или более дополнительные мутации выбирают из K377Е, E387V, D397E, R400H, Q402R, R403H, F405L, D406Y, D406V, N407P, N407H, A421V, L423P, R424G, Q426R, Y430C, K442N, P449S, Y450A, Y450S, Y450H, Y450N, V452I, A456T, R457P, R457Q, W464L, M465R, K468N, E470D, T472A, I473F, I473V, T474A, P475H, W476R, F478Y, F478V, K484M, S487Y, A488V, M495V, M495T, T496A, N497A, F498I, F498Y, L502P, N504S, K506N, P509L, Y515N, F518L, F518I, N522K, N5221, E523K, E523D, L540Q, S541P, I548V, D550N, F553L, V561M, V561A, K562E, E573D, A589T, L598P, D605V, L607P, N609D, N609S, N612Y, N612K, E617K, D618N, D628G, R629G, R635G, K637N, L651P, L651H, K652E, R654H, T657A, G658E, W659R, R661A, R661W, R661L, R661Q, R661S, L666P, K673M, S675C, I679V, L680P, L683P, N690I, R691Q, R691L, N692I, F693Y, Q695A, Q695H, Q695L, H698Q, H698P, S701F, F704S, Q712R, G715S, Q716H, H721R, H723L, I724V, L727H, A728G, A728T, I733V, L738P, Q739E, Q739P и Q739K.
7. Модифицированный Cas9 по п.5, в котором указанные одна или более дополнительных мутаций присутствуют в одном или более положений, выбранных из Y450, M495, Y515, R661, N690, R691, Q695 и H698.
8. Модифицированный Cas9 по п.7, в котором указанные одна или более дополнительных мутаций выбраны из Y450S, M495V, Y515N, R661X, N690I, R691Q, Q695H и H698Q, где X представляет собой L, Q или S.
9. Модифицированный Cas9 по п.7, который содержит:
(a) мутации K526E+Y450S;
(b) мутации K526E+M495V;
(c) мутации K526E+Y515N;
(d) мутации K526E+R661L;
(e) мутации K526E+N690I;
(f) мутации K526E+R691Q;
(g) мутации K526E+Q695H;
(h) мутации K526E+H698Q;
(i) мутации K526E+Y515N+R661X;
(j) мутации K526E+R661L+H698Q;
(k) мутации K526E+M495V+Y515N;
(l) мутации K526E+M495V+R661L;
(m) мутации K526E+M495V+R661X+H698Q;
(n) мутации K526E+M495V+Y515N+R661X или
(o) мутации K526E+R403H+N612Y+L651P+K652E+G715S,
где X представляет собой L, Q или S.
10. Модифицированный Cas9 по п.9, который содержит:
(a) мутации K526E+Y515N+R661L;
(b) мутации K526E+Y515N+R661Q;
(c) мутации K526E+Y515N+R661S;
(d) мутации K526E+M495V+R661L+H698Q;
(e) мутации K526E+M495V+R661Q+H698Q;
(f) мутации K526E+M495V+R661S+H698Q;
(g) мутации K526E+M495V+Y515N+R661L;
(h) мутации K526E+M495V+Y515N+R661Q или
(i) мутации K526E+M495V+Y515N+R661S.
11. Модифицированный Cas9 по п.10, который содержит мутации K526E+M495V+Y515N+R661Q.
12. Модифицированный Cas9 по п.10, который содержит мутации K526E+M495V+Y515N+R661S.
13. Модифицированный Cas9 по п.1, содержащий по меньшей мере одну мутацию, выбранную из K377Е, E387V, D397E, R400H, Q402R, R403H, F405L, D406Y, D406V, N407P, N407H, A421V, L423P, R424G, Q426R, Y430C, K442N, P449S, Y450S, Y450H, Y450N, V452I, A456T, R457P, R457Q, W464L, M465R, K468N, E470D, T472А, I473F, I473V, T474А, P475Н, W476R, F478Y, F478V, K484M, S487Y, A488V, M495V, M495Т, T496А, F498I, F498Y, L502P, N504S, K506N, P509L, Y515N, F518L, F518I, N522K, N522I, E523K, E523D, K526E, K526N, L540Q, S541P, I548V, D550N, F553L, V561M, V561A, K562Е, E573D, А589Т, L598P, D605V, L607P, N609D, N609S, N612Y, N612K, E617K, D618N, D628G, R629G, R635G, K637N, L651P, L651H, K652Е, R654H, T657А, G658E, W659R, R661W, R661L, R661Q, R661S, L666P, K673М, S675C, I679V, L680P, L683P, N690I, R691Q, R691L, N692I, F693Y, Q695H, Q695L, H698Q, H698Р, S701F, F704S, Q712R, G715S, Q716H, H721R, H723L, I724V, L727H, A728G, А728Т, I733V, L738P, Q739E, Q739P и Q739K.
14. Модифицированный белок Cas9, который содержит:
(a) одну мутацию, выбранную из D406Y, W464L, T474А, N612K и L683P; или
(b) двойную мутацию, выбранную из
R400H+Y450S, D406V+E523K, A421V+R661W, R424G+Q739P,
W476R+L738P, P449S+F704S, N522K+G658E, E523D+E617K,
L540Q+L607P, W659R+R661W, S675C+Q695L и I679V+H723L; или
(c) тройную мутацию, выбранную из
K377E+L598P+L651H, D397E+Y430C+L666P, Q402R+V561M+Q695L,
N407P+F498I+P509L, N407H+K637N+N690I, Y450H+F553L+Q716Н,
Y450N+H698P+Q739K, T472A+P475H+A488V, I473F+D550N+Q739E,
F478Y+N522I+L727H, K484M+Q695H+Q712R, S487Y+N504S+E573D,
T496A+N609D+A728G, R654H+R691Q+H698Q и R691L+H721R+I733V;
(d) четверную мутацию, выбранную из
F405L+F518L+L651P+I724V, L423P+M465R+Y515N+K673M, R457P+K468N+R661W+G715S,
E470D+I548V+A589T+Q695H, A488V+D605V+R629G+T657A и M495V+K526N+S541P+K562E;
(e) мутации R403H+N612Y+L651P+K652E+G715S;
(f) шесть мутаций, выбранных из
E387V+V561A+D618N+D628G+L680P+S701F, R403H+K526E+N612Y+L651P+K652E+G715S,
R403H+M495T+N612Y+L651P+K652E+G715S, R403H+L502P+N612Y+L651P+K652E+G715S,
R403H+K506N+N612Y+L651P+K652E+G715S и R403H+N612Y+L651P+K652E+N692I+G715S;
(g) семь мутаций, выбранных из
R403H+A456T+N612Y+L651P+K652E+G715S+G728T,
R403H+F498Y+N612Y+L651P+K652E+R661L+G715S и
R403H+Q426R+F478V+N612Y+L651P+K652E+G715S;
(h) мутации R403H+R442N+V452I+N609S+N612Y+R635G+L651P+K652E+F693Y+G715S или
(i) мутации R403H+R457Q+F518I+N612Y+R635G+L651P+K652E+F693Y+G715S,
где указанные положения мутаций идентифицируют посредством обращения к нумерации аминокислот в немодифицированном зрелом Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9), как приведено в SEQ ID NO: 1.
15. Модифицированный Cas9 по любому из пп.1-14, который представляет собой Cas9 S. pyogenes.
16. Модифицированный Cas9 по любому из пп.1-14, который представляет собой ортолог Cas9 S. pyogenes.
17. Рибонуклеопротеиновый (RNP) комплекс, содержащий модифицированный Cas9 по любому из пп.1-14.
18. Слитый белок, содержащий модифицированный Cas9 по любому из пп.1-16.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированный Cas9 по любому из пп.1-16.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный Cas9 по любому из пп.1-16, RNP по п.17, слитый белок по п.18 или нуклеиновую кислоту по п.19 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент.
21. Способ изменения генома клетки in vitro, где способ включает экспрессию в клетке модифицированного Cas9 по любому из пп.1-16 вместе с гидовой РНК, направленной на конкретную геномную последовательность.