Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 037255

   Библиографические данные
(11)037255    (13) B1
(21)201790698

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2021.02.26
Текущий бюллетень: 2021-02  
Все публикации: 037255  
Реестр евразийского патента: 037255  

(22)2015.10.21
(51) C12N 15/90 (2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
(43)A1 2018.01.31 Бюллетень № 01  тит.лист, описание 
(45)B1 2021.02.26 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)62/067,774
(32)2014.10.23
(33)US
(86)US2015/056653
(87)2016/064999 2016.04.28
(71)РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72)Шень Ин, Бураков Дарья, Чень Ган, Фендл Джэймс П. (US)
(73)РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(74)Карпенко О.Ю., Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Дементьев В.Н., Глухарёва А.О., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(54)НОВЫЕ САЙТЫ ИНТЕГРАЦИИ CHO И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
   Формула 
(57) 1. Выделенная клетка для стабильной интеграции и/или экспрессии экзогенных нуклеиновых кислот, содержащая экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в локус генома клетки, где локус содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, где клетка представляет собой клетку СНО.
2. Клетка по п.1, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит одну или более последовательностей узнавания для рекомбиназы.
3. Клетка по п.2, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере две последовательности узнавания для рекомбиназы и селективный маркер, расположенный между двумя последовательностями узнавания для рекомбиназы.
4. Клетка по п.2, где одна или более последовательностей узнавания для рекомбиназы выбраны из группы, состоящей из сайта LoxP, сайта Lox511, сайта Lox2272, сайта Lox2372, сайта Lox5171, сайта Loxm2, сайта Lox71, сайта Lox66, сайта LoxFas и сайта frt.
5. Клетка по п.1, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит первый экзогенный ген, представляющий интерес (GOI), и первый экзогенный промотор, где первый экзогенный GOI функционально связан с первым экзогенным промотором.
6. Клетка по п.5, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит второй экзогенный GOI и второй экзогенный промотор, где второй экзогенный GOI расположен в направлении 3' от первого GOI и функционально связан со вторым экзогенным промотором.
7. Клетка по п.6, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит первую последовательность узнавания для рекомбиназы в направлении 5' от первого экзогенного GOI и вторую последовательность узнавания для рекомбиназы в направлении 3' от второго экзогенного GOI.
8. Клетка по п.7, где первая и вторая последовательности узнавания для рекомбиназы являются различными и выбраны из группы, состоящей из сайта LoxP, сайта Lox511, сайта Lox2272, сайта Lox2372, сайта Lox5171, сайта Loxm2, сайта Lox71, сайта Lox66, сайта LoxFas и сайта frt.
9. Клетка по п.7, где первый экзогенный GOI кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и второй экзогенный GOI кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
10. Клетка по п.6, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит третий экзогенный GOI и третий экзогенный промотор, где третий экзогенный GOI функционально связан с третьим экзогенным промотором.
11. Клетка по п.10, где третий экзогенный GOI и функционально связанный третий экзогенный промотор расположены в направлении 3' от второго экзогенного GOI.
12. Клетка по п.10, где первый, второй и третий GOI кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из первой легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, второй легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
13. Клетка по п.10, где первый, второй и третий GOI кодируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, первой тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и второй тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
14. Способ для интеграции экзогенной нуклеиновой кислоты в геном клетки СНО, включающий введение в клетку СНО экзогенной нуклеиновой кислоты, где экзогенная нуклеиновая кислота интегрируется в локус генома, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4.
15. Способ по п.14, где экзогенная нуклеиновая кислота содержит одну или несколько последовательностей узнавания для рекомбиназы.
16. Способ по п.15, где экзогенная нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере две последовательности узнавания для рекомбиназы и селективный маркер, расположенный между двумя последовательностями узнавания для рекомбиназы.
17. Способ по п.15, где одна или несколько последовательностей узнавания для рекомбиназы выбраны из группы, состоящей из сайта LoxP, сайта Lox511, сайта Lox2272, сайта Lox2372, сайта Lox5171, сайта Loxm2, сайта Lox71, сайта Lox66, сайта LoxFas и сайта frt.
18. Способ по п.14, где экзогенная нуклеиновая кислота содержит первый экзогенный ген, представляющий интерес (GOI), и первый экзогенный промотор, где первый экзогенный GOI функционально связан с первым экзогенным промотором.
19. Способ по п.18, где экзогенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит второй экзогенный GOI и второй экзогенный промотор, где второй экзогенный GOI функционально связан со вторым экзогенным промотором и расположен в направлении 3' от первого экзогенного GOI.
20. Способ по п.19, где первый экзогенный GOI кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и второй экзогенный GOI кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
21. Способ по п.14, где экзогенную нуклеиновую кислоту вводят с помощью вектора нуклеиновой кислоты, содержащего:
a) 5'-область гомологии, гомологичную последовательности, присутствующей в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4,
b) экзогенную нуклеиновую кислоту и
c) 3'-область гомологии, гомологичную последовательности, присутствующей в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4.
22. Способ по п.21, где экзогенную нуклеиновую кислоту вводят с помощью, по меньшей мере, дополнительного вектора нуклеиновой кислоты или молекулы мРНК.
23. Способ по п.22, где дополнительный вектор выбран из группы, состоящей из аденовируса, лентивируса, ретровируса, аденоассоциированного вируса, интегрирующего фагового вектора, невирусного вектора, транспозона и/или транспозазы, субстрата интегразы и плазмиды, и/или дополнительный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую сайт-специфическую нуклеазу, сайт-специфическая нуклеаза необязательно выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевой нуклеазы (ZFN), димера ZFN, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), белка слияния на основе домена TAL-эффектора и РНК-управляемой ДНК-эндонуклеазы.
24. Способ по п.14, где перед введением экзогенной нуклеиновой кислоты клетка СНО содержит одну или более последовательностей узнавания для рекомбиназы, интегрированных в указанный локус, и где экзогенная нуклеиновая кислота интегрируется в одну или более последовательностей узнавания для рекомбиназы в указанном локусе.
25. Способ по п.24, где перед введением экзогенной нуклеиновой кислоты клетка СНО содержит по меньшей мере две последовательности узнавания для рекомбиназы, интегрированные в указанный локус, и селективный маркер, расположенный между двумя последовательностями узнавания для рекомбиназы.
26. Способ по п.25, где по меньшей мере две последовательности узнавания для рекомбиназы являются различными и выбраны из группы, состоящей из сайта LoxP, сайта Lox511, сайта Lox2272, сайта Lox2372, сайта Lox5171, сайта Loxm 2, сайта Lox71, сайта Lox66, сайта LoxFas и сайта frt.
27. Способ по п.25, где экзогенная нуклеиновая кислота содержит первый экзогенный ген, представляющий интерес (GOI), функционально связанный с первым экзогенным промотором, первую последовательность узнавания для рекомбиназы, расположенную в направлении 5' от первого экзогенного промотора, и вторую последовательность узнавания для рекомбиназы, расположенную в направлении 3' от первого экзогенного GOI, и где первая и вторая последовательности узнавания для рекомбиназы являются идентичными соответственно по меньшей мере двум последовательностям узнавания для рекомбиназы, присутствующим в локусе генома перед введением экзогенной нуклеиновой кислоты.
28. Способ по п.27, где первая и вторая последовательности узнавания для рекомбиназы являются различными и выбраны из группы, состоящей из сайта LoxP, сайта Lox511, сайта Lox2272, сайта Lox2372, сайта Lox5171, сайта Loxm2, сайта Lox71, сайта Lox66, сайта LoxFas и сайта frt.
29. Способ по п.27, где экзогенная нуклеиновая кислота дополнительно содержит второй экзогенный GOI, функционально связанный со вторым экзогенным промотором, где второй экзогенный GOI расположен в направлении 3' от первого экзогенного GOI и в направлении 5' от второй последовательности узнавания для рекомбиназы.
30. Способ по п.29, где первый экзогенный GOI кодирует легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и второй экзогенный GOI кодирует тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
31. Способ для экспрессии гена, представляющего интерес (GOI), включающий:
(а) получение клетки СНО, содержащей экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в локус генома клетки СНО, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты содержит первый экзогенный GOI, функционально связанный с первым экзогенным промотором, и где локус содержит нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, и
(b) культивирование клетки СНО из (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию первого экзогенного GOI.
32. Способ по п.31, где первый экзогенный GOI кодирует первый представляющий интерес белок (POI), и где способ дополнительно предусматривает:
а) извлечение первого POI.
33. Способ по п.31, где экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит второй экзогенный GOI, функционально связанный со вторым экзогенным промотором, и где условия обеспечивают экспрессию первого экзогенного GOI и второго экзогенного GOI.
34. Способ по п.31, где первый экзогенный GOI кодирует легкую цепь антитела, и второй экзогенный GOI кодирует тяжелую цепь антитела.
35. Композиция для модификации генома клетки СНО, содержащая вектор, который содержит:
a) 5'-область гомологии, гомологичную последовательности, присутствующей в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4,
b) экзогенную последовательность нуклеиновой кислоты и
c) 3'-область гомологии, гомологичную последовательности, присутствующей в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4.
36. Композиция по п.35, где последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты содержит одну или более последовательностей узнавания для рекомбиназы и/или содержит первый экзогенный ген, представляющий интерес (GOI).
37. Композиция по п.35 или 36, где композиция содержит, по меньшей мере, дополнительный вектор или молекулу мРНК, при этом необязательно дополнительный вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую сайт-специфическую нуклеазу для интеграции последовательности узнавания, и где необязательно сайт-специфическая нуклеаза выбрана из группы, состоящей из цинк-пальцевой нуклеазы (ZFN), димера ZFN, эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), белка слияния на основе домена TAL-эффектора или РНК-управляемой ДНК-эндонуклеазы.
Zoom in