Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 037120

   Библиографические данные
(11)037120    (13) B1
(21)201791751

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2021.02.09
Текущий бюллетень: 2021-02  
Все публикации: 037120  
Реестр евразийского патента: 037120  

(22)2016.02.02
(51) C12N 15/11 (2006.01)
C12N 15/63 (2006.01)
C12N 15/85(2006.01)
(43)A1 2018.02.28 Бюллетень № 02  тит.лист, описание 
(45)B1 2021.02.09 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)62/110,919
(32)2015.02.02
(33)US
(86)US2016/016234
(87)2016/126747 2016.08.11
(71)МЕИРЭДЖТИЭКС ЮКей II ЛИМИТЕД (GB)
(72)Бойн Алекс Р., Дэйнос Ф. Оливье, Воллес Дж. Майкл, Го Сюэцуй (US)
(73)МЕИРЭДЖТИЭКС ЮКей II ЛИМИТЕД (GB)
(74)Медведев В.Н. (RU)
(54)РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПОСРЕДСТВОМ АПТАМЕР-ОПОСРЕДОВАННОГО МОДУЛИРОВАНИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА
   Формула 
(57) 1. Полинуклеотидная кассета для регулирования экспрессии целевого гена, содержащая:
(a) рибосвитч;
(b) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном,
при этом рибосвитч содержит (i) эффекторную область, содержащую стебель, который включает 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и (ii) аптамер,
при этом альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки (считывания) с целевым геном, когда альтернативно сплайсированный экзон сплайсирован в мРНК целевого гена.
2. Полинуклеотидная кассета по п.1, отличающаяся тем, что аптамер специфически связывается с низкомолекулярным лигандом.
3. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1, 2, отличающаяся тем, что 5'- и 3'-интроны:
(a) получают из эндогенного интрона из целевого гена;
(b) являются экзогенными для целевого гена или
(c) получают из интрона 2 гена b-глобина человека.
4. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном.
5. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину, предпочтительно 5'-и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину.
6. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что стебель эффекторной области имеет от около 7 до около 20 пар оснований в длину, предпочтительно стебель эффекторной области имеет от 8 до 11 пар оснований в длину.
7. Полинуклеотидная кассета по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что альтернативно сплайсированный экзон:
(a) получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека, экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1 человека, экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II дельта мыши или экзона 6 SIRT1;
(b) модифицирован посредством одного или более процессов, выбранных из группы, состоящей из изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного сайленсера сплайсинга;
(c) представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR человека из SEQ ID NO: 15 или
(d) является синтетическим.
8. Способ модулирования экспрессии целевого гена, включающий:
(a) вставку полинуклеотидной кассеты по любому из пп.1-6 в целевой ген;
(b) введение целевого гена, содержащего полинуклеотидную кассету, в клетку; а также
(c) воздействие на клетку низкомолекулярным лигандом, который специфически связывается с аптамером в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету вставляют в область целевого гена, кодирующую белок.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что уровень экспрессии целевого гена при наличии низкомолекулярного лиганда выше примерно в 5 раз или выше примерно в 10 раз по сравнению с уровнями экспрессии при отсутствии низкомолекулярного лиганда.
11. Способ по любому из пп.8-10, отличающийся тем, что в целевой ген вставляют две или более полинуклеотидные кассеты.
12. Способ по любому из пп.8-11, отличающийся тем, что указанные две или более полинуклеотидные кассеты содержат различные аптамеры, которые специфически связываются с различными низкомолекулярными лигандами, или отличающийся тем, что указанные две или более полинуклеотидные кассеты содержат одинаковый аптамер.
13. Способ по любому из пп.8-12, отличающийся тем, что целевой ген, содержащий полинуклеотидную кассету, вводят в вектор для экспрессии целевого гена.
14. Способ модулирования экспрессии целевого гена в глазу млекопитающего, включающий:
(a) введение в глаз вектора, содержащего целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету, содержащую (i) рибосвитч и (ii) альтернативно сплайсированный экзон, граничащий с 5'-интроном и 3'-интроном, при этом рибосвитч содержит эффекторную область, содержащую стебель, который содержит 5'-участок сплайсинга 3'-интрона, и аптамер, который связывается с низкомолекулярным лигандом, при этом альтернативно сплайсированный экзон содержит стоп-кодон, который находится внутри рамки с целевым геном;
(b) воздействие на млекопитающего низкомолекулярным лигандом в количестве, эффективном для индуцирования экспрессии целевого гена.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что вектор вводят в глаз с помощью внутриглазной инъекции.
16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
18. Способ по любому из пп.8-17, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету помещают в кодирующую белок последовательность целевого гена.
19. Способ по любому из пп.8-18, отличающийся тем, что 5'-и 3'-интроны:
(a) получают из эндогенного интрона из целевого гена;
(b) являются экзогенными для целевого гена или
(c) получают из интрона 2 гена b-глобина человека.
20. Способ по любому из пп.8-19, отличающийся тем, что 5'-интрон содержит стоп-кодон в рамке с целевым геном.
21. Способ по любому из пп.8-20, отличающийся тем, что 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 50 до около 300 нуклеотидов в длину, предпочтительно 5'- и 3'-интроны, каждый независимо, имеют от около 125 до около 240 нуклеотидов в длину.
22. Способ по любому из пп.8-21, отличающийся тем, что стебель эффекторной области имеет от около 7 до около 20 пар оснований в длину, предпочтительно стебель эффекторной области имеет от 8 до 11 пар оснований в длину.
23. Способ по любому из пп.8-22, отличающийся тем, что альтернативно сплайсированный экзон:
(a) получают из экзона 2 гена дигидрофолатредуктазы человека, экзона 5 мутантной опухоли Вильмса 1 человека, экзона 16 кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы II дельта мыши или экзона 6 SIRT1;
(b) модифицирован посредством одного или более процессов, выбранных из группы, состоящей из изменения последовательности экзонного энхансера сплайсинга, изменения последовательности экзонного сайленсера сплайсинга, добавления экзонного энхансера сплайсинга и добавления экзонного сайленсера сплайсинга;
(c) представляет собой модифицированный экзон 2 DHFR человека из SEQ ID NO: 15 или
(d) является синтетическим.
24. Рекомбинантный полинуклеотид, содержащий целевой ген с полинуклеотидной кассетой по любому из пп.1-7.
25. Рекомбинантный полинуклеотид по п.24, отличающийся тем, что полинуклеотидную кассету помещают в кодирующую белок последовательность целевого гена.
26. Вектор, содержащий целевой ген, который содержит полинуклеотидную кассету по любому из пп.1-7.
27. Вектор по п.26, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вирусный вектор.
28. Вектор по п.27, отличающийся тем, что указанный вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, вектора аденоассоциированного вируса и лентивирусного вектора.
Zoom in