Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 036610

   Библиографические данные
(11)036610    (13) B1
(21)201890851

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.11.30
Текущий бюллетень: 2020-11  
Все публикации: 036610  
Реестр евразийского патента: 036610  

(22)2016.09.27
(51) C07K 14/33 (2006.01)
C12N 9/52(2006.01)
(43)A1 2018.08.31 Бюллетень № 08  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.11.30 Бюллетень № 11  тит.лист, описание  последовательности 
(31)1517450.1
(32)2015.10.02
(33)GB
(86)EP2016/072986
(87)2017/055274 2017.04.06
(71)ИПСЕН БИОФАРМ ЛИМИТЕД (GB)
(72)Хэкетт Стефен Гэвин, Палан Шилпа, Андерсон Дина Брэди (GB)
(73)ИПСЕН БИОФАРМ ЛИМИТЕД (GB)
(74)Медведев В.Н. (RU)
(54)СПОСОБ ОЧИСТКИ НЕЙРОТОКСИНА КЛОСТРИДИЙ
   Формула 
(57) 1. Способ очистки ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A), включающий:
(a) контактирование катионообменной смолы с композицией, содержащей BoNT/A, где стадию контактирования проводят в загрузочном буфере с рН более чем на -1 единицу ниже, чем вычисленная pI BoNT/A, где указанную стадию контактирования катионообменной смолы с композицией, содержащей указанный BoNT/A, проводят до превращения указанного BoNT/A из одноцепочечной формы в двухцепочечную форму;
(b) отделение BoNT/A от катионообменной смолы с использованием элюирующего буфера;
(c) выделение одноцепочечного BoNT/A по существу в чистом состоянии.
2. Способ по п.1, где значение рН составляет:
(a) по меньшей мере приблизительно рН 7,5 (предпочтительно приблизительно рН 7,6, предпочтительно по меньшей мере приблизительно рН 7,7, а более предпочтительно по меньшей мере приблизительно рН 7,8);
(b) приблизительно от рН 7,3 до рН 9,5 или
(c) приблизительно от рН 7,3 до рН 8,0.
3. Способ по п.1 или 2, где выделенный BoNT/A находится по существу в чистом состоянии, где необязательно:
(a) выделенный BoNT/A составляет по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99,9% от общей концентрации белка и/или
(b) по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% примесей удаляют из BoNT/A.
4. Способ по любому из пп.1-3, где:
(а) катионообменная смола представляет собой (i) сильную катионообменную смолу, необязательно содержащую сульфоновую кислоту; (ii) слабую катионообменную смолу, необязательно содержащую карбоксиметил; (iii) комбинацию сильных и слабых катионообменных смол или (iv) смолу смешанного типа, которая действует как катионообменная смола, предпочтительно слабая катионообменная смола; и/или
(b) буфер содержит один или более из NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2 и (NH4)2SO4; и/или
(c) композиция, содержащая BoNT/A, представляет собой бесклеточный экстракт и/или клеточный лизат.
5. Промежуточный продукт очистки, содержащий BoNT/A, связанный с катионообменной смолой, где промежуточный продукт очистки имеет рН по меньшей мере 6,5, более предпочтительно по меньшей мере рН 7,3, где катионнообменная смола контактирует с указанным BoNT/A до превращения указанного BoNT/A из одноцепочечной формы в двухцепочечную форму и где необязательно BoNT/A является BoNT/A, содержащим аминокислотную последовательность UniProtKB с регистрационным номером Р10845 или его модифицированную форму.
6. Промежуточный продукт очистки, содержащий BoNT/A, который был отделен от катионообменной смолы, где промежуточный продукт очистки имеет рН по меньшей мере 6,5, более предпочтительно по меньшей мере рН 7,3, где катионнообменная смола контактирует с указанным BoNT/A до превращения указанного BoNT/A из одноцепочечной формы в двухцепочечную форму и где необязательно BoNT/A является BoNT/A, содержащим аминокислотную последовательность UniProtKB с регистрационным номером Р10845 или его модифицированную форму.
7. Промежуточный продукт очистки по п.5 или 6, где:
(a) BoNT содержит последовательность смежных аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 20 или 22; и/или
(b) катионообменная смола представляет собой (i) сильную катионообменную смолу, необязательно содержащую сульфоновую кислоту; (ii) слабую катионообменную смолу, необязательно содержащую карбоксиметил; (iii) комбинацию сильных и слабых катионообменных смол или (iv) смолу смешанного типа, которая действует как катионообменная смола, предпочтительно слабая катионообменная смола.
8. Промежуточный продукт очистки по любому из пп.5-7, где BoNT/A представляет собой катионный BoNT/A.
9. Промежуточный продукт очистки по любому из пп.5-8, где значение рН составляет:
(a) по меньшей мере приблизительно рН 7,5 (предпочтительно приблизительно рН 7, 6, предпочтительно по меньшей мере приблизительно рН 7,7, а более предпочтительно по меньшей мере приблизительно рН 7,8);
(b) приблизительно от рН 7,3 до рН 9,5 или
(c) приблизительно от рН 7,3 до рН 8,0.
10. Применение загрузочного буфера, имеющего значение рН, которое составляет -1 или выше, чем вычисленная pI одноцепочечного BoNT/A, в целях контактирования композиции, содержащей BoNT/A, с катионообменной смолой до превращения указанной одноцепочечной формы в двухцепочечную форму, для повышения уровня связывания и/или увеличения выхода одноцепочечного BoNT/A по сравнению с применением рН, значение которого составляет более чем на -1 единицу рН ниже, чем вычисленная pI указанного BoNT/A в одинаковых условиях, где буфер содержит бис-трис (пропан), бис-трис (метан), Трис, HEPES, цитрат или фосфат.
11. Применение по п.10, где значение рН составляет:
(a) по меньшей мере 6,5;
(b) по меньшей мере равно (предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 0,2 единицы рН выше, а более предпочтительно по меньшей мере на 0,5 единицы рН выше) вычисленной pI указанного BoNT/A;
(c) приблизительно на 0,2-1,5 единиц рН выше вычисленной pI указанного BoNT/A;
(d) приблизительно на 0,2-1,0 единиц рН выше вычисленной pI указанного BoNT/A.
12. Способ или применение по любому из пп.1-4 или 10, 11, где контактирование катионообменной смолы с композицией, содержащей BoNT/A, представляет собой первую стадию очистки (например, первую стадию хроматографической очистки).
13. Способ или применение по любому из пп.1-4 или 10-12, где очистка включает одну или более дополнительных стадий.
14. Способ или применение по п.13, где одна или более дополнительных стадий включают контактирование композиции, содержащей BoNT/A, с одной или более дополнительными смолами и где необязательно:
(a) контактирование с одной или более дополнительными смолами осуществляют после стадии контактирования катионообменной смолы с композицией, содержащей BoNT/A; и/или
(b) одну и/или более дополнительных стадий выбирают из группы, состоящей из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии, хроматографии смешанного типа, гидрофобной хроматографии с индукцией заряда, гель-фильтрации и аффинной хроматографии;
где предпочтительно способ включает дополнительную стадию анионообменной хроматографии после стадии контактирования катионообменной смолы с композицией, содержащей BoNT/A.
15. Способ или применение по п.13 или 14, где одна или более дополнительных стадий включают превращение BoNT/A из одноцепочечной формы в двухцепочечную форму с последующим выделением одноцепочечного BoNT/A.
16. Способ или применение по любому из пп.1-4 или 10-15, где по меньшей мере 35% (предпочтительно по меньшей мере 40, 50 60, 70 или 80%) всего BoNT/A, содержащегося в композиции, связаны с катионообменной смолой.
17. Способ или применение по любому из пп.1-4 или 10-16, где:
(a) BoNT/A представляет собой BoNT/A, содержащий аминокислотную последовательность UniProtKB P10845 или его модифицированную форму; и/или
(b) BoNT/A содержит последовательность смежных аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, 18, 20 или 22.
18. Способ или применение по любому из пп.1-4 или 10-17, где BoNT/A представляет собой катионный BoNT/A.
19. BoNT/A, получаемый способом или с применением по любому из пп.1-4 или 10-18 и/или выделенный из промежуточного продукта очистки по любому из п.п.5-9, где BoNT/A имеет аминокислотную последовательность, как определено в любом из пп.4-6.
20. BoNT/A по п.19, где:
(a) указанный BoNT/A находится по существу в чистом состоянии и/или
(b) выделенный BoNT/A составляет по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 99% или по меньшей мере 99,9% от общей концентрации белка.