Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 035266

   Библиографические данные
(11)035266    (13) B1
(21)201691548

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.05.22
Текущий бюллетень: 2020-05  
Все публикации: 035266  
Реестр евразийского патента: 035266  

(22)2015.03.02
(51) C12N 15/09(2006.01)
(43)A1 2017.02.28 Бюллетень № 02  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.05.22 Бюллетень № 05  тит.лист, описание  SEQL 
(31)14157324.6
(32)2014.02.28
(33)EP
(86)EP2015/054331
(87)2015/128509 2015.09.03
(71)ИКНОС САЙЕНСИЗ СА (CH)
(72)Эбишер-Гуми Кристель, Моретти Пьер, Бертшингер Мартин (CH)
(73)ИКНОС САЙЕНСИЗ СА (CH)
(74)Нилова М.И. (RU)
(54)ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ КОНСТРУКЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ОТБОРА КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ПОЛИПЕПТИДЫ
   Формула 
(57) 1. Экспрессирующая конструкция, содержащая в направлении от 5' к 3'
промотор;
первый экзон, кодирующий полипептид, представляющий интерес, где указанный полипептид, представляющий интерес, содержит тяжелую цепь антитела или её фрагмент;
донорный сайт сплайсинга, интрон и акцепторный сайт сплайсинга, причем первый стоп-кодон расположен между указанным донорным сайтом сплайсинга и указанным акцепторным сайтом сплайсинга в пределах указанного интрона;
второй экзон, кодирующий трансмембранную область, которая выбрана из модифицированной трансмембранной области иммуноглобулина или модифицированной или немодифицированной трансмембранной области, отличной от трансмембранной области иммуноглобулина;
второй стоп-кодон; и
поли(A)-сайт,
причем после поступления в клетку-хозяин транскрипция указанного первого и второго экзонов приводит к экспрессии указанного полипептида, представляющего интерес, и экспонированию части полипептида, представляющего интерес, на поверхности мембраны клетки-хозяина.
2. Экспрессирующая конструкция по п.1, отличающаяся тем, что указанная трансмембранная область содержит от 17 до 29 остатков, предпочтительно от 19 до 26 остатков и, наиболее предпочтительно, от 21 до 24 остатков.
3. Экспрессирующая конструкция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что указанная трансмембранная область, отличная от трансмембранной области иммуноглобулина, выбрана из группы, включающей трансмембранную область рецептора фактора роста тромбоцитов человека (PDGFR), асиалогликопротеинового рецептора человека, B7-1 человека и мыши, ICAM-1 человека, erbb1 человека, erbb2 человека, erbb3 человека, erbb4 человека, рецепторов фактора роста фибробластов человека, таких как FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, VEGFR-1 человека, VEGFR-2 человека, рецептора эритропоэтина человека, PRL-R человека, рецептора пролактина, EphA1 человека, рецептора 1 эфрина типа A, рецепторов инсулина, IGF-1 человека, рецептороподобных тирозинфосфатаз белков человека, нейропилина человека, главного комплекса гистосовместимости класса II человека (цепи альфа и бета), интегринов человека (семейства альфа и бета), синдеканов человека, белка миелина человека, кадгеринов человека, синаптобревина-2 человека, гликофорина-A человека, Bnip3 человека, APP человека, белка-предшественника амилоида, рецептора T-клеток альфа и бета человека, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 дзета и CD3 эпсилон.
4. Экспрессирующая конструкция по п.1, отличающаяся тем, что указанная трансмембранная область, отличная от трансмембранной области иммуноглобулина, представляет собой трансмембранную область B7-1 мыши (SEQ ID NO: 173), ACLV1 (SEQ ID NO: 174), ANTR2 (SEQ ID NO: 175), CD4 (SEQ ID NO: 176), PTPRM (SEQ ID NO: 177), TNR5 (SEQ ID NO: 178), ITB1 (SEQ ID NO: 179), IGF1R (SEQ ID NO: 181), 1B07 (SEQ ID NO: 180), TRMB (SEQ ID NO: 182), IL4RA (SEQ ID NO: 183), LRP6 (SEQ ID NO: 184), GpA (SEQ ID NO: 185), PTCRA (SEQ ID NO: 186).
5. Экспрессирующая конструкция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанный интрон содержит поли(A)-сайт.
6. Экспрессирующая конструкция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что акцепторный сайт сплайсинга указанного интрона содержит поли(Y)-участок и при этом содержание Y в указанном поли(Y)-участке модифицируют посредством изменения количества пиримидиновых оснований в нем.
7. Экспрессирующая конструкция по любому из пп.1-6, содержащая по меньшей мере одну область точки разветвления, отличающаяся тем, что последовательность указанной по меньшей мере одной области точки разветвления является модифицированной относительно консенсусной последовательности области точки разветвления CTRAYY (SEQ ID NO: 347).
8. Экспрессирующая конструкция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что консенсусная последовательность указанного донорного сайта сплайсинга интрона является модифицированной.
9. Полинуклеотид, содержащий экспрессирующую конструкцию по любому из пп.1-8.
10. Вектор клонирования или экспрессии, содержащий один или более полинуклеотидов по п.9.
11. Клетка-хозяин, содержащая один или более векторов клонирования или экспрессии по п.10.
12. Клетка-хозяин по п.11, содержащая вектор экспрессии, который содержит полинуклеотид, кодирующий экспрессирующую конструкцию по п.8 для экспрессии тяжелой цепи антитела, и вектор экспрессии, который содержит полинуклеотид, кодирующий экспрессирующую конструкцию для экспрессии легкой цепи антитела.
13. Клетка-хозяин по п.11, содержащая вектор экспрессии, который содержит полинуклеотид, кодирующий экспрессирующую конструкцию по п.8 для экспрессии тяжелой цепи антитела, вектор экспрессии, который содержит полинуклеотид, кодирующий экспрессирующую конструкцию по п.8 для экспрессии scFv-Fc, и вектор экспрессии, который содержит полинуклеотид, кодирующий экспрессирующую конструкцию для экспрессии легкой цепи антитела.
14. Способ получения полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп.11-13 в культуре и выделение полипептида, экспрессированного из культуры.
15. Способ отбора клетки-хозяина, экспрессирующей полипептид, представляющий интерес, причем указанный способ включает:
(i) трансфекцию клетки-хозяина экспрессирующей конструкцией по п.1;
(ii) культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии полипептида, представляющего интерес;
(iii) обнаружение экспрессии полипептида, представляющего интерес, на мембране клетки; и
(iv) отбор клетки-хозяина, экспонирующей полипептид, представляющий интерес, на поверхности мембраны клетки на желаемом уровне экспрессии.
16. Способ отбора клетки-хозяина, экспрессирующей гетеромультимерный полипептид, представляющий интерес, причем указанный способ включает:
(i) котрансфекцию клетки-хозяина, по меньшей мере, экспрессирующей конструкцией по п.1, кодирующей первый полипептид, представляющий интерес, и экспрессирующей конструкцией по п.1, кодирующей второй полипептид, представляющий интерес;
(ii) культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии гетеромультимерного полипептида, представляющего интерес;
(iii) обнаружение экспрессии гетеромультимерного полипептида, представляющего интерес, на мембране клетки; и
(iv) отбор клетки-хозяина, экспонирующей желаемый гетеромультимерный полипептид, представляющий интерес, на поверхности мембраны клетки на желаемом уровне экспрессии.
17. Способ отбора клетки-хозяина, экспрессирующей биспецифичное антитело, причем указанный способ включает:
(i) котрансфекцию клетки-хозяина экспрессирующей конструкцией по п.1, кодирующей тяжелую цепь антитела, экспрессирующей конструкцией по п.1, кодирующей scFv-Fc, и экспрессирующей конструкцией, кодирующей легкую цепь антитела;
(ii) культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии биспецифичного антитела;
(iii) обнаружение экспрессии биспецифичного антитела на клеточной мембране; и
(iv) отбор клетки-хозяина, экспонирующей желаемое биспецифичное антитело на поверхности клеточной мембраны на желаемом уровне экспрессии.