Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 035178

   Библиографические данные
(11)035178    (13) B1
(21)201692439

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел:      


Документ опубликован 2020.05.12
Текущий бюллетень: 2020-05  
Все публикации: 035178  
Реестр евразийского патента: 035178  

(22)2015.06.03
(51) C12N 9/62(2006.01)
(43)A1 2017.04.28 Бюллетень № 04  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.05.12 Бюллетень № 05  тит.лист, описание  SEQL 
(31)14170879.2; 14172644.8; 14172645.5
(32)2014.06.03; 2014.06.17; 2014.06.17
(33)EP; EP; EP
(86)EP2015/062328
(87)2015/185593 2015.12.10
(71)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72)Лан ван дер Ян Метске, Брёйне-Паулус де Ангела, Кристис Шанталь, Спанс Мартине, Вондерворт ван де Петер Йозеф Ида (NL)
(73)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(74)Бадаева Т.Н., Фелицына С.Б. (RU)
(54)ПРОЛИН-СПЕЦИФИЧНАЯ ЭНДОПРОТЕАЗА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
   Формула 
(57) 1. Полипептид, обладающий активностью пролин-специфичной эндопротеазы, где полипептид выбран из группы, состоящей из:
i) полипептида, который, когда выровнен относительно аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1, содержит аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ala (A), Cys (С), Asp (D), Phe (F), Gly (G), His (H), Ile (I), Lys (K), Leu (L), Met (M), Asn (N), Gln (Q), Arg (R), Ser (S), Thr (T), Val (V), Trp (W) и Tyr (Y), в положении, соответствующем положению 469;
ii) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, в соответствии с SEQ ID NO: 1, где SEQ ID NO: 1 содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Р469А, Р469С, P469D, P469F, P469G, Р469Н, P469I, Р469K, P469L, Р469М, P469N, P469Q, P469R, P469S, Р469Т, P469V, P469W и P469Y;
iii) полипептида по (i), (ii), но утратившего сигнальную последовательность и/или последовательности пропротеина;
iv) полипептида по (i)-(iv), где полипептид идентичен по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1;
v) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая идентична по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 2 или зрелой кодирующей последовательности SEQ ID NO: 2, где последовательность SEQ ID NO: 2 содержит по меньшей мере одну мутацию, кодирующую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы Р469А, Р469С, P469D, P469F, P469G, Р469Н, P469I, Р469K, P469L, Р469М, P469N, P469Q, P469R, P469S, Р469Т, P469V, P469W и P469Y;
vi) полипептида по (i)-(iv), где полипептид дополнительно содержит аминокислотную замену I204F, P304S, Р377А, Р466Т и/или Р477А; и
vii) полипептида по (v), где SEQ ID NO: 2 дополнительно содержит мутацию, кодирующую аминокислотную замену I204F, P304S, Р377А, Р466Т и/или Р477А.
2. Полипептид по п.1, где указанный полипептид имеет менее чем 70% остаточной активности на ацетил-AlaAlaPro-паранитроанилине (Ac-AAP-PNA) в качестве субстрата после выдержки полипептида при температуре 65°C в течение 15 мин.
3. Полипептид, который представляет собой выделенный, по существу чистый, чистый, рекомбинантный, синтетический или вариантный полипептид полипептида по п.1 или 2.
4. Способ получения вариантного полипептида, который включает:
i) отбор исходного полипептида, идентичного по меньшей мере на 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1 или зрелому полипептиду по SEQ ID NO: 1; и
ii) замену по меньшей мере одной аминокислоты в положении, соответствующем положению 469, на аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Ala (A), Cys (С), Asp (D), Phe (F), Gly (G), His (H), Ile (I), Lys (K), Leu (L), Met (M), Asn (N), Gln (Q), Arg (R), Ser (S), Thr (T), Val (V), Trp (W) и Tyr (Y); и
iii) получение вариантного полипептида,
где вариантный полипептид имеет менее 70% остаточной активности на ацетил-AlaAlaPro-паранитроанилине (Ac-AAP-PNA) в качестве субстрата после того, как полипептид был выдержан при температуре 65°C в течение 15 мин.
5. Способ по п.4, дополнительно предусматривающий замену аминокислоты в положении 204 на Phe (F), в положении 304 на Ser (S), в положении 377 на Ala (А), в положении 466 на Thr (T) и/или в положении 477 на Ala (A).
6. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-3, предназначенная для использования в производстве пищевого продукта или корма.
7. Композиция по п.6, содержащая носитель, наполнитель или вспомогательный фермент.
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая пролин-специфичную эндопротеазу, которая идентична по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 2 или зрелой кодирующей последовательности по SEQ ID NO: 2, где последовательность SEQ ID NO: 2 содержит по меньшей мере одну мутацию, кодирующую по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Р469А, Р469С, P469D, Р469Е, P469F, P469G, Р469Н, P469I, Р469K, P469L, Р469М, P469N, P469Q, P469R, P469S, Р469Т, P469V, P469W, P469Y, где аминокислотные замены определяются относительно SEQ ID NO: 1.
9. Нуклеиновая кислота по п.8, где SEQ ID NO: 2 содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, кодирующую аминокислотную замену I204F, P304S, Р377А, Р466Т и/или Р477А.
10. Нуклеиновая кислота, которая представляет собой выделенную, по существу чистую, чистую, рекомбинантную, синтетическую или вариантную нуклеиновую кислоту нуклеиновой кислоты по п.8 или 9.
11. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.8 или 9, функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией полипептида в клетке-хозяине.
12. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.8 или 9 или экспрессирующий вектор по п.11.
13. Способ получения полипептида по п.1 или 3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.12 в подходящей среде для ферментации в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида, и получение полипептида.
14. Способ по п.13, далее включающий выделение полипептида.
15. Способ приготовления пищевого или кормового продукта, включающий взаимодействие промежуточной формы пищевого или кормового продукта с полипептидом по пп.1-3 или композиции по п.6 или 7 и приготовление пищевого или кормового продукта.
16. Способ по п.15, в котором пищевой продукт представляет собой напиток, предпочтительно пиво.
17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что пищевой продукт содержит глютен.
18. Пищевой или кормовой продукт, получаемый способом по любому из пп.15-17.