Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 035092

   Библиографические данные
(11)035092    (13) B1
(21)201692157

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.04.27
Текущий бюллетень: 2020-04  
Все публикации: 035092  
Реестр евразийского патента: 035092  

(22)2015.05.15
(51) C12N 15/10 (2006.01)
C12Q 1/68(2006.01)
(43)A1 2017.05.31 Бюллетень № 05  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.04.27 Бюллетень № 04  тит.лист, описание  последовательности 
(31)14168313.6
(32)2014.05.14
(33)EP
(86)EP2015/060777
(87)2015/173402 2015.11.19
(71)БУРВИНКЕЛЬ БАРБАРА; ТУРЧИНОВИЧ АНДРЕЙ (DE)
(72)Турчинович Андрей, Суровы Харальд, Бурвинкель Барбара (DE)
(73)БУРВИНКЕЛЬ БАРБАРА; ТУРЧИНОВИЧ АНДРЕЙ (DE)
(74)Нилова М.И. (RU)
(54)СИНТЕЗ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
   Формула 
(57) 1. Способ синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты с определенной 3'- и 5'-концевой последовательностью нуклеотидов с использованием образца, содержащего одноцепочечную нуклеиновую кислоту, включающий следующие этапы:
a) обеспечение образца, содержащего одноцепочечную или двухцепочечную нуклеиновую кислоту, возможно, денатурирование указанной двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
b) добавление по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов к 3'-концу указанной одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
c) осуществление гибридизации инициирующего олигонуклеотида, комплементарного указанной добавленной последовательности нуклеотидов, и синтез кДНК или кРНК посредством зависимой от матрицы ДНК- или РНК-полимеразы с получением двухцепочечной нуклеиновой кислоты;
d) осуществление гибридизации олигонуклеотида, переключающего матрицу, с указанной двухцепочечной нуклеиновой кислотой; и
e) удлинение 3'-конца цепи кДНК или кРНК для синтеза двухцепочечной нуклеиновой кислоты, при этом одна цепь указанной нуклеиновой кислоты содержит указанный инициирующий олигонуклеотид и кДНК или кРНК, которая комплементарна указанной одноцепочечной нуклеиновой кислоте и указанному олигонуклеотиду, переключающему матрицу.
2. Способ согласно п.1, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой:
(i) жидкий или твердый биоптат или получен из жидкого или твердого биоптата, более предпочтительно указанный образец представляет собой образец крови, образец плазмы, образец сыворотки, образец биологической жидкости, образец слюны, образец мочи, образец семенной жидкости, образец жидкости из плевральной полости, образец жидкости из перитонеальной полости, образец спинномозговой жидкости, мазок с поверхности эпителия, образец мокроты, образец кала, образец эякулята, образец слезы, образец пота, образец лимфатической жидкости, образец бронхиального лаважа, образец плеврального выпота, образец менингеальной жидкости, образец секрета железы, образец тонкоигольного пунктата, микропрепарированные клетки, жидкий образец аспирата наконечником, образец спинномозговой жидкости, образец конъюнктивальной жидкости, образец вагинальной жидкости, образец дуоденальной жидкости, образец сока поджелудочной железы или образец желчи или
(ii) получен из ископаемых остатков, останков вымерших организмов, растений, плодов и животных, микробов, бактерий или вирусов.
3. Способ согласно любому из пп.1-2, отличающийся тем, что:
(i) указанная одноцепочечная нуклеиновая кислота представляет собой ДНК, предпочтительно фрагментированную и/или обработанную бисульфитом ДНК, или РНК, предпочтительно миРНК, малую РНК, piPHK или обработанную бисульфитом РНК, и/или
(ii) указанные последовательные нуклеотиды идентичны или состоят из идентичных динуклеотидов, тринуклеотидов, квадрануклеотидов, пентануклеотидов или полинуклеотидов, при этом указанные последовательные идентичные нуклеотиды предпочтительно выбраны из группы, состоящей из рибо-, дезоксирибонуклеотидов или дидезоксирибонуклеотидов А, Т, G, С или U, или выбраны из группы, состоящей из двух или более рибо- или дезоксирибодинуклеотидов, и более предпочтительно указанные идентичные рибо-, дезоксирибонуклеотиды или дидезоксирибонуклеотиды присоединяют с использованием фермента, выбранного из группы, состоящей из поли(А)-полимеразы, поли(U)-полимеразы, поли(G)-полимеразы, концевой трансферазы, ДНК-лигаз, РНК-лигаз, и указанные динуклеотиды и тринуклеотиды присоединяют РНК-лигазы, и/или
(iii) реакцию добавления хвоста полинуклеотидов осуществляют со смесью двух или более рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов, и/или
(iv) инициирующий олигонуклеотид содержит следующие элементы последовательности нуклеотидов:
3'-Wm-X-Yn-Z1o-Qt-Z2s-5', где
W в каждом случае независимо выбран из dA, dG, dC, dT и dU;
X выбран из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT и rU;
Y представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, последовательность которого на 80% или более состоит из идентичных нуклеотидов или динуклеотидов, выбранных из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT, rU, AC, AG, AT, AU, CA, CG, CT, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и UT, и на остальные 20% или менее состоит из нуклеотидов или динуклеотидов, которые отличны от основного нуклеотида или динуклеотида и также выбраны из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT, rU, AC, AG, AT, AU, CA, CG, CT, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и/или UT, при условии, что X отличен от нуклеотида или динуклеотида, который составляет большую часть Y;
Q представляет собой последовательность идущих друг за другом вырожденных (неоднозначных) оснований ДНК, предпочтительно выбранных из N, V, Н, D, В и J, где N представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT, dC и dG; В представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dT, dC и dG; D представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dG; H представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dC; V представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dC и dG; J представляет собой продукт включения нуклеотида из смеси (0-100% dA) с (0-100% dG), с (0-100% dC), с (0-100% dT), с (0-100% dU), с (0-100% rA), с (0-100% rG), с (0-100% rC), с (0-100% rT), с (0-100% rU);
Z1 представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов с определенной последовательностью, при этом указанная последовательность отличается от Wm-X-Yn, предпочтительно указанная последовательность также отличается от Qt -Z2s;
Z2 представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов с определенной последовательностью, при этом указанная последовательность отличается от Wm-X-Yn-Z1o-Qt;
m представляет собой целое число от 0 до 6, т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
n представляет собой целое число от 10 до 100, если Y выбран из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT и rU, целое число от 5 до 50, если Y выбран из AC, AG, AT, AU, СА, CG, CT, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и UT;
о представляет собой 0 или 1;
s представляет собой 0 или 1; и
t представляет собой целое число от 0 до 6, т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
при этом предпочтительно Z1 и/или Z2 выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.
4. Способ согласно любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид, переключающий матрицу,
(i) представлен формулой
5'-Xp-Y-Qt-Zq-Ar-3' где
X представляет собой химическую группу, выбранную из группы, состоящей из остатка амина, биотина, глицерина, холестерина, дигоксигенина, фтора или производных нуклеотида, включая нуклеотиды без азотистых оснований, дидезоксирибонуклеотиды, 3'-дезоксинуклеотиды, 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксиуридин;
Y представляет собой известную олигонуклеотидную последовательность;
Q представляет собой последовательность идущих друг за другом вырожденных (неоднозначных) оснований ДНК, предпочтительно выбранных из N, V, Н, D, В и J, где N представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT, dC и dG; В представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dT, dC и dG; D представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dG; H представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dC; V представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dC и dG; J представляет собой продукт включения нуклеотида из смеси (0-100% dA) с (0-100% dG), с (0-100% dC), с (0-100% dT), с (0-100% dU), с (0-100% rA), с (0-100% rG), с (0-100% rC), с (0-100% rT), с (0-100% rU);
Z представляет собой рибонуклеотид, выбранный из группы, состоящей из AMP, CMP, GMP, ТМР и UMP;
А представляет собой химическую группу, выбранную из группы, состоящей из остатка амина, биотина, глицерина, холестерина, дигоксигенина, фосфата, фтора или производных нуклеотида, включая нуклеотиды без азотистых оснований, дидезоксирибонуклеотиды, 3'-дезоксинуклеотиды, 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксиуридин;
t представляет собой целое число от 0 до 6, т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
р представляет собой целое число от 0 до 10, т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
q представляет собой целое число, равное по меньшей мере 1; и
r представляет собой целое число от 0 до 10, т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, и/или
(ii) выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.
5. Способ согласно любому из пп.1-4, отличающийся тем, что указанная обратная транскриптаза
(i) обладает активностью ДНК-полимеразы и активностью концевой трансферазы и/или
(ii) способна переключаться на матрицу, содержащую двухцепочечную нуклеиновую кислоту ДНК/РНК и/или ДНК/ДНК.
6. Способ согласно любому из пп.1-5, дополнительно включающий этап иммобилизации синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты на поверхности.
7. Способ согласно любому из пп.1-6, который дополнительно включает этап f), включающий отжиг с двухцепочечной нуклеиновой кислотой, синтезированной на этапе е), по меньшей мере одного праймера, идентичного, комплементарного или способного гибридизоваться по меньшей мере с частью указанного инициирующего олигонуклеотида или олигонуклеотида, переключающего матрицу, и осуществление ПЦР-амплификации, и предпочтительно включающий этап иммобилизации продукта ПЦР-амплификации и/или предпочтительно дополнительно включающий этап определения по меньшей мере части последовательности указанной одноцепочечной нуклеиновой кислоты.
8. Инициирующий олигонуклеотид, содержащий следующие элементы последовательности:
3'-Wm-X-Yn-Z1-Qt-Z2-5', где
W в каждом случае независимо выбран из dA, dG, dC, dT и dU;
X выбран из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT и rU;
Y представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 10 нуклеотидов, последовательность которого состоит по меньшей мере из 80% идентичных нуклеотидов или динуклеотидов, выбранных из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT, rU, AC, AG, AT, AU, CA, CG, CT, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и UT, а на остальные 20% состоит из нуклеотидов или динуклеотидов, которые отличаются от основного нуклеотида или динуклеотида и также выбраны из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT, rU, AC, AG, AT, AU, CA, CG, CT, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и UT, при условии, что X отличен от Y;
Q представляет собой последовательность идущих друг за другом вырожденных (неоднозначных) оснований ДНК, предпочтительно выбранных из N, V, Н, D, В и J, где N представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT, dC и dG; В представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dT, dC и dG; D представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dG; H представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dC; V представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dC и dG; J представляет собой продукт включения нуклеотида из смеси (0-100% dA) с (0-100% dG), с (0-100% dC), с (0-100% dT), с (0-100% dU), с (0-100% rA), с (0-100% rG), с (0-100% rC), с (0-100% rT), с (0-100% rU);
Z1 представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов с определенной последовательностью, при этом указанная последовательность отличается от Wm-X-Yn-Qt-Z2s;
Z2 представляет собой полинуклеотид длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов с определенной последовательностью, при этом указанная последовательность отличается от Wm-X-Yn-Z1o-Qt;
m представляет собой целое число от 1 до 6, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
n представляет собой целое число от 10 до 100, если Y выбран из dA, dG, dC, dT, dU, rA, rG, rC, rT и rU, целое число от 5 до 50, если Y выбран из AC, AG, AT, AU, CA, CG, СТ, CU, GA, GC, GT, GU, ТА, ТС, TG, TU, AA, CC, GG, TT, UU, UA, UC, UG и UT;
t представляет собой целое число от 1 до 6, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
при этом предпочтительно последовательность указанного олигонуклеотида выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20.
9. Олигонуклеотид, переключающий матрицу, содержащий следующие элементы последовательности:
5'-X-Y-Zq-3', где
X представляет собой химическую группу, выбранную из группы, состоящей из остатка амина, биотина, глицерина, холестерина, дигоксигенина, фтора или производных нуклеотида, включая нуклеотиды без азотистых оснований, дидезоксирибонуклеотиды, 3'-дезоксинуклеотиды, 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксиуридин;
Y представляет собой известную олигонуклеотидную последовательность;
Z представляет собой рибонуклеотид, выбранный из группы, состоящей из AMP, CMP, GMP, ТМР и UMP;
q представляет собой целое число, равное по меньшей мере 1.
10. Олигонуклеотид, переключающий матрицу, по п.9, который дополнительно содержит элемент последовательности Ar и имеет следующу структру:
5'-X-Y-Zq-Ar-3',
где X, Y, Z и q являются такими, как определено в п.9, и при этом
А представляет собой химическую группу, выбранную из группы, состоящей из остатка амина, биотина, глицерина, холестерина, дигоксигенина, фосфата, фтора или производных нуклеотида, включая нуклеотиды без азотистых оснований, дидезоксирибонуклеотиды, 3'-дезоксинуклеотиды, 2'-дезоксиинозин, 2'-дезоксиуридин;
r представляет собой целое число от 1 до 10, т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, предпочтительно 1.
11. Олигонуклеотид, переключающий матрицу, по п.9 или 10, кокторый дополнително содержит элемент последовательности Qt и имеет следующую структуру:
5'-X-Y-Qt-Zq-Ar-3' или
5'-X-Y-Qt-Zq-3', где
X, Y, Z, А, r и q являются такими, как определено в п.9 или 10, и при этом
Q представляет собой последовательность идущих друг за другом вырожденных (неоднозначных) оснований ДНК, предпочтительно выбранных из N, V, Н, D, В и J, где N представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT, dC и dG; В представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dT, dC и dG; D представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dG; H представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dT и dC; V представляет собой продукт включения нуклеотида из эквимолярной смеси dA, dC и dG; J представляет собой продукт включения нуклеотида из смеси (0-100% dA) с (0-100% dG), с (0-100% dC), с (0-100% dT), с (0-100% dU), с (0-100% rA), с (0-100% rG), с (0-100% rC), с (0-100% rT), с (0-100% rU); и
t представляет собой целое число от 1 до 6, т.е. 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
12. Нуклеиновая кислота, содержащая инициирующий олигонуклеотид по п.8 или его компоненты.
13. Набор, содержащий:
a) реагент, способный добавлять нуклеотиды к 3'-концу одноцепочечной нуклеиновой кислоты, предпочтительно независимую от матрицы ДНК- или РНК-полимеразу, более предпочтительно поли(А)-полимеразу или концевую трансферазу, и блокирующий нуклеотид, предпочтительно 3d-NTP, 3-Me-NTP и ddNTP;
b) фермент обратную транскриптазу;
c) инициирующий олигонуклеотид согласно п.8 и
d) олигонуклеотид, переключающий матрицу,
предпочтительно дополнительно содержащий реагенты для ПЦР-амплификации и/или целевого обогащения мишенью и/или предпочтительно дополнительно содержащий фермент, способный расщеплять пептидные связи в белках.
14. Чип, содержащий по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту согласно п.12.
15. Применение набора согласно п.13 для получения двухцепочечной ДНК, которую можно напрямую секвенировать.
16. Применение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, синтезированной согласно способу по любому из пп.1-7, или одноцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной из нее, для секвенирования или анализа экспрессии, клонирования, мечения, для идентификации генов или определенных последовательностей нуклеотидов.
17. Применение двухцепочечной нуклеиновой кислоты, синтезированной согласно способу по любому из пп.1-7, или одноцепочечной нуклеиновой кислоты, полученной из нее, в персонализированной медицине; для мониторинга терапии; предсказания, прогнозирования, раннего обнаружения заболевания человека или животного, или для судебной медицины, для анализа последовательностей нуклеиновых кислот вирусов, бактерий, грибов, животных или растений или клеток, полученных из них, предпочтительно для характеристики растений, плодов, проверки скрещивания, обнаружения заболеваний растений или плодов.