Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 034953

   Библиографические данные
(11)034953    (13) B1
(21)201501004

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.04.10
Текущий бюллетень: 2020-04  
Все публикации: 034953  
Реестр евразийского патента: 034953  

(22)2015.08.03
(51) C12Q 1/68 (2006.01)
C12N 15/11(2006.01)
(43)A1 2017.02.28 Бюллетень № 02  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.04.10 Бюллетень № 04  тит.лист, описание 
(96)2015000072 (RU) 2015.08.03
(71)ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ДЖИНЭКСТ" (RU)
(72)Тороповский Андрей Николаевич, Никитин Алексей Георгиевич, Викторов Денис Александрович, Жмырко Екатерина Викторовна, Гордиев Марат Гордиевич (RU)
(73)ТОВАРИЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ &qout;МЕДИТЕК&qout; (KZ)
(74)Михайлов А.В. (RU)
(54)СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
   Формула 
(57) 1. Способ получения дезоксирибонуклеиновых праймеров (ДНК-праймеров) и зондов для неинвазивной диагностики рака предстательной железы посредством определения уровня экспрессии гена PCA3 по генетическому материалу из образца мочи пациента, в котором используют:
(а) образец кодирующей дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК), соответствующей рибонуклеиновой кислоте (РНК) гена PCA3 (prostate cancer antigen 3);
(б) образец кДНК, соответствующей РНК гена KLK3 (kallikrein-3);
(в) образец кДНК, соответствующей РНК гена СОМТ (catechol-O-methyltransferase);
(г) образец геномной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) человека;
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) синтезируют прямой и обратный праймеры, удовлетворяющие одному или сразу обоим из следующих требований:
(i) один или оба праймера комплементарны экзон-экзонным переходам, длина участка экзона, комплементарного 3'-концу праймера от 10 до 3 нуклеотидов, 3'-конец межэкзонного праймера не комплементарен соответствующему интрону в геномной ДНК одним или более нуклеотидом, и обязательно последним нуклеотидом 3'-конца,
(ii) между внутриэкзонными или межэкзонными участками кДНК, комплементарными праймерам, в геномной ДНК присутствует интрон длиной не менее 1000 пар нуклеотидов;
(2) проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) образца (г) с вышеуказанными праймерами;
(3) отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие отсутствие реакции на образце геномной ДНК;
(4) проводят полимеразную цепную реакцию с сериями по меньшей мере из четырех 10-кратных разведений образцов (а), (б) и (в);
(5) отбирают пары праймеров и зонды, обеспечивающие эффективность полимеразной цепной реакции выше 65% и линейность при изменении относительной концентрации образцов (а) (б), (в) выше 0,9.
2. Набор для неинвазивной ПЦР-диагностики рака предстательной железы посредством определения уровня экспрессии гена PCA3 по генетическому материалу из образца мочи пациента, содержащий для каждого из трех генов PCA3, KLK3 и СОМТ по меньшей мере одну пару из прямого и обратного праймеров и по меньшей мере один соответствующий им зонд, при этом упомянутые праймеры и зонд отвечают тем же требованиям, что и праймеры и зонд, синтезированные и отобранные способом по п.1.
3. Набор по п.2, характеризующийся тем, что размер ампликона, соответствующий парным (прямому и обратному) праймерам, составляет целое число в диапазоне от 60 до 300 пар нуклеотидов, предпочтительно целое число в диапазоне от 100 до 250 пар нуклеотидов.
4. Набор по п.2, характеризующийся тем, что в нем прямой праймер, обратный праймер и зонд для СОМТ выбраны из группы олигонуклеотидов, включающей (в строках ниже первым указан прямой праймер, вторым - обратный праймер, третьим - зонд):
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 13,
SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33
и гомологичные им по меньшей мере на 95% олигонуклеотиды.
5. Набор по п.2, характеризующийся тем, что в нем прямой праймер, обратный праймер и зонд для KLK3 выбраны из группы олигонуклеотидов, включающей (в строках ниже первым указан прямой праймер, вторым - обратный праймер, третьим - зонд):
SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43,
SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 43,
SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 43,
SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73,
SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 и
гомологичные им по меньшей мере на 95% олигонуклеотиды.
6. Набор по п.2, характеризующийся тем, что в нем прямой праймер, обратный праймер и зонд для PCA3 выбраны из группы олигонуклеотидов, включающей (в строках ниже первым указан прямой праймер, вторым - обратный праймер, третьим - зонд):
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 93,
SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173 и
и гомологичные им по меньшей мере на 95% олигонуклеотиды.
7. Набор по любому из пп.2-6, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя кДНК для осуществления положительного контроля.
8. Набор по любому из пп.2-7, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя термостабильную ДНК-полимеразу 10 ед/мкл.
9. Набор по любому из пп.2-8, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя водный раствор, содержащий
приблизительно 67 мМ трис-HCl, рН 8,8 при 25°C,
приблизительно 16,6 мМ (NH4)2SO4,
приблизительно 6,7 мМ MgCl2,
приблизительно 6,7 мкм ЭДТА,
приблизительно 170 мкг БСА и
смесь четырех основных dNTP в концентрации приблизительно 0,2 мМ каждого.
10. Набор по любому из пп.2-9, характеризующийся тем, что он дополнительно включает в себя деионизированную воду.
11. Способ диагностики рака предстательной железы, в котором используют:
(а) образец мочи пациента;
(б) набор по любому из пп.2-9;
(в) набор, включающий рандомные и/или олгиго-дТ и/или специфические праймеры, ревертазу, dNTP и буфер для обратной транскрипции,
характеризующийся тем, что он предусматривает следующие стадии:
(1) выделяют РНК из образца (а);
(2) проводят обратную транскрипцию РНК, выделенной на стадии (1) набором (в);
(3) проводят количественную полимеразную цепную реакцию продуктов обратной транскрипции, полученных на стадии (2), посредством праймеров из набора (б), состоящую из начального плавления и ряда циклов из плавления, отжига и синтеза;
(4) определяют количество продуктов полимеразной цепной реакции, полученных на стадии (3), посредством флуоресцентной спектрометрии в присутствии зондов из набора (б).
12. Способ по п.11, характеризующийся тем, что на стадии (3) начальное плавление проводят в течение 1-5 мин при температуре 94-96°C, цикл, включающий плавление в течение 10-30 с при температуре 94-96°C, проводят 30-60 раз,
отжиг и синтез при температуре 58-66°C осуществляют в течение 30-60 мин,
а детекцию продуктов полимеразной цепной реакции проводят во время стадии отжига.
13. Способ по любому из пп.11 или 12, характеризующийся тем, что в нем обратную транскрипцию проводят 50-150 единицами ревертазы в течение 30-90 мин при температуре 36-43°C.
14. Способ по любому из пп.11-13, характеризующийся тем, что в нем концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 400±100 нМ, зондов - 200±50 нМ, а температура отжига - 60±5°C.
15. Способ по любому из пп.11-14, характеризующийся тем, что в нем в качестве диагностического показателя используют соотношение между сигналами от зондов для PCA3 и сигналами от зондов KLK3 и/или СОМТ.