Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 034556

   Библиографические данные
(11)034556    (13) B1
(21)201692440

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.02.19
Текущий бюллетень: 2020-02  
Все публикации: 034556  
Реестр евразийского патента: 034556  

(22)2015.06.03
(51) C12N 9/62(2006.01)
(43)A1 2017.05.31 Бюллетень № 05  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.02.19 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)14170879.2; 14172644.8
(32)2014.06.03; 2014.06.17
(33)EP; EP
(86)EP2015/062325
(87)2015/185590 2015.12.10
(71)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72)Лан Ван Дер Ян Метске, Брёйне-Паулус Де Ангела, Кристис Шанталь, Спанс Мартине, Вондерворт Ван Де Петер Йозеф Ида (NL)
(73)ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(74)Бадаева Т.Н., Фелицына С.Б. (RU)
(54)ПРОЛИН-СПЕЦИФИЧНАЯ ЭНДОПРОТЕАЗА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
   Формула 
(57) 1. Полипептид, обладающий активностью пролин-специфичной эндопротеазы, где полипептид выбран из группы, состоящей из:
i) полипептида, который содержит аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1, где SEQ ID NO: 1 содержит по меньшей мере одну комбинацию аминокислотных замен, выбранную из группы, состоящей из комбинаций (K238E, I204V, V460A), (F279S, A242V, N507I), (Т145А, K424M), (Т359А, F379S), (M170I, А421Т), (N441S, G484S), (L470H, Q288R), (L470H, E387G), (T281S, L373I), (Р304А, Р469А) и (Р466Т, P469Q), где положения определяются относительно SEQ ID NO: 1;
ii) полипептида по i), но утратившего сигнальную последовательность и/или последовательность пропротеина;
iii) полипептида по i) или ii), где полипептид идентичен по меньшей мере на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1; и
iv) полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, которая идентична по меньшей мере на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 2 или зрелой кодирующей последовательности SEQ ID NO: 2, где SEQ ID NO: 2 содержит по меньшей мере одну мутацию, кодирующую по меньшей мере одну комбинацию аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из (K238E, 1204V, V460A), (F279S, A242V, N507I), (Т145А, K424M), (Т359А, F379S), (M170I, А421Т), (N441S, G484S), (L470H, Q288R), (L470H, E387G), (T281S, L373I), (Р304А, Р469А) и (Р466Т, P469Q), где аминокислотные замены определяются со ссылкой на SEQ ID NO: 1; и
v) полипептид по любому одному из пп.i)-iv), где полипептид содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену I204F, Y205N или Р477А, где указанный полипептид не содержит аминокислотную замену I204F, когда полипептид имеет аминокислотные замены K238E, I204V и V460A.
2. Полипептид, обладающий активностью пролин-специфичной эндопротеазы, где полипептид имеет менее чем 70% остаточной активности на ацетил-AlaAlaPro-паранитроанилине (Ac-AAP-PNA) в качестве субстрата после выдержки полипептида при температуре 65°C в течение 15 мин.
3. Полипептид, который представляет собой выделенный, по существу, чистый, чистый, рекомбинантный, синтетический или вариантный полипептид полипептида по п.1 или 2.
4. Способ получения вариантного полипептида, который включает:
i) отбор исходного полипептида, идентичного по меньшей мере на 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности по SEQ ID NO: 1 или зрелому полипептиду SEQ ID NO: 1; и
ii) замену по меньшей мере одной комбинации аминокислот, являющейся результатом комбинации аминокислот, выбранных из группы, состоящей из (Glu (E) в положении 238, Val (V) в положении 204, Ala (А) в положении 460), (Ser (S) в положении 279, Val (V) в положении 242, Ile (I) в положении 507), (Thr (T) в положении 145, Met (M) в положении 424), (Ala (А) в положении 359, Ser (S) в положении 379), (Ile (I) в положении 170, Thr (T) в положении 421), (Ser (S) в положении 441, Ser (S) в положении 484), (His (H) в положении 470, Arg (R) в положении 288), (His (H) в положении 470, Gly (G) в положении 387), (Ser (S) в положении 281, Ile (I) в положении 373), (Ala в положении 304, Ala в положении 469) и (Thr (T) в положении 466, Gln (Q) в положении 469), где положения определяются относительно SEQ ID NO: 1; и
iii) получение вариантного полипептида.
5. Способ по п.4, в котором стадия (ii) дополнительно включает замену по меньшей мере одной дополнительной аминокислоты, что приводит к появлению Phe (F) в положении 204, Asp (N) в положении 205 или Ala (А) в положении 477, где полипептид не содержит аминокислотную замену Phe (F), если полипептид имеет аминокислотную замену Glu (E) в положении 238, Val (V) в положении 204, Ala (А) в положении 460).
6. Способ по п.4 или 5, где вариантный полипептид содержит менее 70% остаточной активности на ацетил-AlaAlaPro-паранитроанилине (Ac-AAP-PNA) в качестве субстрата после того, как полипептид был выдержан при температуре 65°C в течение 15 мин.
7. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-3, для использования для приготовления пищевого продукта.
8. Композиция по п.7, содержащая носитель, наполнитель или вспомогательный фермент.
9. Нуклеиновая кислота, кодирующая пролин-специфичную эндопротеазу, которая идентична по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 2 или зрелой кодирующей последовательности SEQ ID NO: 2, где SEQ ID NO: 2 включает по меньшей мере одну мутацию, кодирующую по меньшей мере одну комбинацию аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из (K238E, I204V, V460A), (F279S, A242V, N507I), (Т145А, K424M), (Т359А, F379S), (M170I, А421Т), (N441S, G484S), (L470H, Q288R), (L470H, E387G), (T281S, L373I), (Р304А, Р469А) и (Р466Т, P469Q), и где аминокислотные замены определяются со ссылкой на последовательность SEQ ID NO: 1.
10. Нуклеиновая кислота по п.9, которая содержит дополнительно по меньшей мере одну аминокислотную замену I204F, Y205N или Р477А, где полипептид не содержит аминокислотную замену I204F, если полипептид имеет аминокислотные замены K238E, I204V и V460A.
11. Нуклеиновая кислота, которая представляет собой выделенную, по существу, чистую, чистую, рекомбинантную, синтетическую или вариантную нуклеиновую кислоту нуклеиновой кислоты по п.9 или 10.
12. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.9-11, функционально связанный по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, которая управляет экспрессией полипептида в клетке-хозяине.
13. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по пп.9-11, или экспрессирующий вектор по п.12.
14. Способ получения полипептида по пп.1-3, включающий культивирование клетки-хозяина по п.13 в подходящей среде для ферментации, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида, и получение полипептида.
15. Способ по п.14, дополнительно включающий выделение полипептида.
16. Способ приготовления пищевого или кормового продукта, включающий взаимодействие промежуточной формы пищевого или кормового продукта с полипептидом по пп.1-3 или композицией по п.7 или 8 и приготовление пищевого или кормового продукта.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что пищевой продукт представляет собой напиток, предпочтительно пиво.
18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что пищевой продукт содержит глютен.
19. Пищевой или кормовой продукт, получаемый способом по любому из пп.16-18.