Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 034531

   Библиографические данные
(11)034531    (13) B1
(21)201690196

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел:      


Документ опубликован 2020.02.18
Текущий бюллетень: 2020-02  
Все публикации: 034531  
Реестр евразийского патента: 034531  

(22)2014.08.07
(51) A61K 35/74 (2015.01)
A23L 1/30 (2006.01)
C12N 1/20 (2006.01)
A61P 1/00(2006.01)
(43)A1 2016.12.30 Бюллетень № 12  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.02.18 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)13382324.5
(32)2013.08.09
(33)EP
(86)EP2014/066970
(87)2015/018883 2015.02.12
(71)АБ-БИОТИКС, С.А. (ES)
(72)Кунье Кастельана Хорди, Ласаро Мальен Элизабет, Эспадалер Масо Хорди (ES)
(73)АБ-БИОТИКС, С.А. (ES)
(74)Поликарпов А.В., Соколова М.В., Путинцев А.И., Черкас Д.А., Игнатьев А.В. (RU)
(54)КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БАКТЕРИИ PEDIOCOCCUS PENTOSACEUS, ИНДУЦИРУЮЩИЕ ОБРАЗОВАНИЕ IL-10 THP-1 МАКРОФАГАМИ
   Формула 
(57) 1. Бактериальная композиция для снижения воспаления в кишечном тракте, содержащая от 104 до 1012 КОЕ/г жизнеспособных клеток Pediococcus pentosaceus, обладающих способностью индуцировать образование интерлейкина-10 ТНР-1 макрофагами в способе, включающем следующие стадии:
а) обеспечение дифференцировки ТНР-1 моноцитов в макрофаги путем выращивания ТНР-1 моноцитов клеточной линии РНЕ88081201 в среде RPMI 1640 с 10% FBS и с форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) до конечной концентрации 0,16 мкМ;
б) выращивание ТНР-1 макрофагов в среде RPMI 1640 с 10% FBS в 24-луночных планшетах для ELISA до конечной концентрации 106 макрофагов/лунка;
в) инкубирование в течение 2,5 ч ТНР-1 макрофагов с липополисахаридом (LPS) в конечной концентрации 10 нг/мл и промывание ТНР-1 макрофагов средой на основе D-PBS;
г) приготовление культуры клеток Pediococcus pentosaceus посредством выращивания их в течение ночи в среде MRS при 37°C в атмосфере с 5% CO2;
д) добавление в лунки для ELISA 500 мкл среды RPMI 1640 с 10% FBS и подходящего количества разведения клеток Pediococcus pentosaceus для получения конечного соотношения 25:1 (2,5´107 КОЕ клеток Pediococcus pentosaceus: 106 ТНР-1 макрофагов);
е) инкубирование ТНР-1 макрофагов с клетками Pediococcus pentosaceus в течение 2,5 ч при 37°C, а также без клеток Pediococcus pentosaceus в таких же условиях в качестве отрицательного контроля;
ж) промывание ТНР-1 макрофагов средой D-PBS для удаления клеток Pediococcus pentosaceus, затем добавление к ТНР-1 макрофагам среды RPMI 1640 с 10% FBS, дополненной 50 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл ампициллина и 12 мкг/мл хлорамфеникола, инкубирование при 37°C при 5-7% CO2 и отбор аликвот через 5 и через 24 ч;
з) центрифугирование аликвот и анализ супернатантов посредством проточной цитометрии для количественного определения интерлейкина-10;
и) вычисление нормированного увеличения концентрации интерлейкина-10 по формуле (IL-1024ч - IL-10)/IL-10, где IL-10 и IL-1024ч представляют собой концентрацию интерлейкина-10 через 5 и через 24 ч соответственно.
2. Бактериальная композиция по п.1, где продукция интерлейкина-10 ТНР-1 макрофагами в присутствии клеток Pediococcus pentosaceus, выраженная в виде нормированного увеличения, по меньшей мере в 2 раза больше продукции интерлейкина-10 ТНР-1 макрофагами в отсутствие клеток Pediococcus pentosaceus.
3. Бактериальная композиция по любому из пп.1, 2, где клетки Pediococcus pentosaceus обладают способностью к антагонизму в отношении грамположительных и грамотрицательных кишечных бактерий, причем способность к антагонизму определена посредством следующих стадий:
1) равномерное распределение патогенных штаммов в чашках, содержащих среду Oxoid, и выращивание до конфлюэнтности в CO2-инкубаторе при подходящих для роста каждого патогена температурах и % CO2;
2) приведение двух цилиндрических сегментов конфлюэнтной агаровой среды, равномерно засеянной клетками Pediococcus pentosaceus, диаметром 6 мм в контакт с засеяннной патогеном средой, при расположении как (а) ростовой стороны одного цилиндрического сегмента вплотную к засеянной патогеном среде, так и (б) неростовой стороны другого цилиндрического сегмента вплотную к засеянной патогеном среде; и инкубирование в течение ночи при 37°C;
3) измерение на следующий день зон ингибирования посредством размещения чашки с агаром на плоской линейке;
4) вычисление ингибирующей рост активности (GI) посредством вычитания диаметра цилиндра (CD) из диаметра зоны ингибирования (IZD), измеренных в сантиметрах, и деления этой разности на 2 по формуле
GI = (IZD - CD)/2.
4. Бактериальная композиция по п.3, где грамположительные бактерии включают бактерии, выбранные из Clostridium difficile и Enterococcus faecalis.
5. Бактериальная композиция по п.3, где грамотрицательные бактерии включают бактерии, выбранные из Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca и Bacteroides vulgatus.
6. Бактериальная композиция по п.3, где клетки Pediococcus pentosaceus обладают способностью к антагонизму в отношении Clostridium difficile, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella oxytoca и Bacteroides vulgatus.
7. Бактериальная композиция по любому из пп.1-6, где Pediococcus pentosaceus представляет собой Pediococcus pentosaceus CECT 8330.
8. Бактериальная композиция по любому из пп.1-7, дополнительно содержащая от 104 до 1012 КОЕ/г клеток Bifidobacterium longum CECT 7894.
9. Применение бактериальной композиции по любому из пп.1-8 в уменьшении интенсивности плача у младенцев.