Евразийский сервер публикаций

Евразийский патент № 034459

   Библиографические данные
(11)034459    (13) B1
(21)201690081

 A ]   B ]   C ]   D ]   E ]   F ]   G ]   H ] 

Текущий раздел: C     


Документ опубликован 2020.02.11
Текущий бюллетень: 2020-02  
Все публикации: 034459  
Реестр евразийского патента: 034459  

(22)2014.08.05
(51) C12Q 1/68(2006.01)
(43)A1 2016.10.31 Бюллетень № 10  тит.лист, описание 
(45)B1 2020.02.11 Бюллетень № 02  тит.лист, описание  последовательности 
(31)61/862,445; 61/862,457
(32)2013.08.05; 2013.08.05
(33)US; US
(86)US2014/049834
(87)2015/021080 2015.02.12
(71)ТВИСТ БАЙОСАЙЕНС КОРПОРЕЙШН (US)
(72)Баниайи Уильям, Пек Билл Джеймс, Фернандез Андрес, Чэнь Сыюань, Индермуле Пьер (US)
(73)ТВИСТ БАЙОСАЙЕНС КОРПОРЕЙШН (US)
(74)Строкова О.В. (RU)
(54)СИНТЕЗИРОВАННЫЕ DE NOVO БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ
   Формула 
(57) 1. Способ синтеза нуклеиновых кислот, включающий:
(a) обеспечение предварительно определенных последовательностей по меньшей мере 750 предварительно выбранных нуклеиновых кислот, которые будут синтезированы;
(b) обеспечение структуры, имеющей поверхность, при этом поверхность содержит множество локусов для полинуклеотидного удаления, причем указанная поверхность содержит предварительно определенные области, покрытые молекулой, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом;
(c) синтез по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, прикрепленных к поверхности, при этом каждый из по меньшей мере 20000 неидентичных полинуклеотидов имеет длину по меньшей мере 80 оснований;
(d) высвобождение по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов с поверхности;
(e) суспендирование по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов в растворе; и
(f) подвергание раствора, содержащего по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, реакции полимеразной цепной сборки для сборки по меньшей мере 750 предварительно выбранных нуклеиновых кислот, при этом по меньшей мере 750 собранных предварительно выбранных нуклеиновых кислот кодируют последовательности с частотой суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями без исправления ошибок по меньшей мере в 750 собранных предварительно выбранных нуклеиновых кислотах, и при этом поверхность обеспечивает частоту суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, прикрепленных к поверхности, образуют кластеры, при этом каждый кластер отделен от другого кластера структурным барьером на поверхности, и при этом каждый кластер включает поднабор из по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, которые совместно кодируют единичную нуклеиновую кислоту.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что каждый поднабор, состоящий по меньшей мере из 30000 неидентичных полинуклеотидов, совместно кодирует единичную нуклеиновую кислоту и расположен в пределах канала диаметром от 0,5 до 1,5 мм.
4. Способ по п.1, при этом каждая предварительно определенная область окружена областью, покрытой молекулой, которая связывается с поверхностью и лишена доступной реакционноспособной группы, которая связывается с нуклеозид-фосфорамидитом.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и лишена доступной реакционноспособной группы, которая связывается с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой фторсилан.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что фторсилан представляет собой (тридекафтортетрагидрооктил)триэтоксисилан.
7. Способ по п.4, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой аминосилан.
8. Способ по п.4, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой 11-ацетоксиундецилтриэтоксисилан, н-децилтриэтоксисилан, (3-аминопропил)триметоксисилан, (3-аминопропил)триэтоксисилан или N-(3-триэтоксисилилпропил)-4-гидроксибутирамид.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, высвобождаемых с поверхности, образуют кластеры, при этом каждый кластер включает поднабор из по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов, и при этом поднабор из по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов совместно кодирует единичную нуклеиновую кислоту.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов высвобождаются путем отщепления под действием газа.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадии с (a) по (f) выполняют за менее чем 7 дней.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что собранные по меньшей мере 750 предварительно выбранных нуклеиновых кислот имеют длину в среднем по меньшей мере 1 kb.
13. Способ по п.1, дополнительно включающий обработку собранных по меньшей мере 750 предварительно выбранных нуклеиновых кислот ферментом для коррекции ошибок.
14. Способ по п.1, в котором по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой ошибки менее чем 1 в 1000 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями для по меньшей мере 30000 неидентичных полинуклеотидов.
15. Способ синтеза нуклеиновых кислот, включающий:
(a) обеспечение предварительно определенных последовательностей по меньшей мере 6000 предварительно выбранных нуклеиновых кислот, которые будут синтезированы;
(b) обеспечение структуры, имеющей поверхность, при этом поверхность содержит предварительно определенные области, покрытые силаном, и при этом каждая предварительно определенная область, покрытая силаном, окружена областью, покрытой фрагментом, который связывается с поверхностью и лишен доступной реакционноспособной группы, которая связывается с нуклеозид-фосфорамидитом;
(c) синтез около 750000 неидентичных полинуклеотидов, прикрепленных к поверхности, при этом каждый из около 750000 неидентичных полинуклеотидов имеет длину по меньшей мере 125 оснований и проходит от поверхности в предварительно определенных областях, покрытых силаном;
(d) высвобождение около 750000 неидентичных полинуклеотидов с поверхности;
(e) суспендирование около 750000 неидентичных полинуклеотидов в растворе; и
(f) подвергание раствора, содержащего около 750000 неидентичных полинуклеотидов, реакции полимеразной цепной сборки для сборки по меньшей мере 6000 предварительно выбранных нуклеиновых кислот, при этом по меньшей мере 6000 собранных предварительно отобранных нуклеиновых кислот кодируют последовательности с частотой суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями без коррекции ошибок в собранных по меньшей мере 6000 предварительно выбранных нуклеиновых кислотах, и при этом поверхность обеспечивает частоту суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях.
16. Способ по п.15, в котором по меньшей мере 750000 неидентичных полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой ошибки менее чем 1 в 1000 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями для по меньшей мере 750000 неидентичных полинуклеотидов.
17. Способ синтеза библиотеки полинуклеотидов, кодирующих предварительно определенные последовательности, при этом способ включает:
(a) обеспечение предварительно определенных последовательностей для библиотеки, состоящей по меньшей мере из 100000 неидентичных полинуклеотидов;
(b) обеспечение структуры, имеющей поверхность, содержащую множество локусов для удлинения полинуклеотидной цепи;
(c) добавление капли жидкости, содержащей реагент для реакции удлинения цепи, специфический к локусу;
(d) обеспечение достаточного количества времени для проведения реакции удлинения цепи; и
(e) повторение стадий (c) и (d) для синтеза по меньшей мере 100000 неидентичных полинуклеотидов, при этом каждый неидентичный полинуклеотид имеет длину по меньшей мере 10 оснований и прикреплен к поверхности в предварительно определенном локусе, и при этом по меньшей мере 100000 синтезированных неидентичных полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями, и при этом поверхность обеспечивает частоту суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях.
18. Способ по п.17, включающий покрытие множества локусов молекулой, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой силан.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что силан представляет собой аминосилан.
21. Способ по п.18, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и способна связываться с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой 11-ацетоксиундецилтриэтоксисилан, н-децилтриэтоксисилан, (3-аминопропил)триметоксисилан, (3-аминопропил)триэтоксисилан или N-(3-триэтоксисилилпропил)-4-гидроксибутирамид.
22. Способ по п.17, включающий покрытие поверхности молекулой, которая связывается с поверхностью и лишена доступной реакционноспособной группы, которая связывается с нуклеозид-фосфорамидитом.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что молекула, которая связывается с поверхностью и лишена доступной реакционноспособной группы, которая связывается с нуклеозид-фосфорамидитом, представляет собой фторсилан.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что фторсилан представляет собой (тридекафтортетрагидрооктил)триэтоксисилан.
25. Способ по п.17, отличающийся тем, что все локусы из множества локусов отделены друг от друга структурным барьером поверхности.
26. Способ по п.17, отличающийся тем, что стадии с (a) по (e) выполняют менее чем за 7 дней.
27. Способ по п.17, дополнительно включающий отщепление по меньшей мере 100000 неидентичных полинуклеотидов от поверхности с помощью газообразного аммиака или газообразного метиламина.
28. Способ по п.17, в котором по меньшей мере 100000 неидентичных полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой ошибки менее чем 1 в 1000 основаниях по сравнению с предварительно определенными последовательностями для по меньшей мере 100000 неидентичных полинуклеотидов.
29. Полинуклеотидная библиотека кДНК, синтезированная по любому из способов по пп.1-28, основанная на инструкциях, предоставленных в машиночитаемом энергонезависимом носителе, причем библиотека содержит по меньшей мере 30000 полинуклеотидов на основании инструкций, предоставленных в машиночитаемом энергонезависимом носителе, и причем по меньшей мере 30000 полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой суммарных ошибок менее чем 1 в 800 основаниях по сравнению с последовательностями, полученными в инструкциях, предоставленных в машиночитаемом энергонезависимом носителе.
30. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, в которой по меньшей мере 30000 полинуклеотидов кодируют последовательности с частотой суммарных ошибок менее чем 1 в 1000 основаниях по сравнению с последовательностями, полученными в инструкциях, предоставленных в машиночитаемом энергонезависимом носителе.
31. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, в которой каждый из по меньшей мере 30000 полинуклеотидов содержит первую перекрывающуюся область, которая комплементарна второй перекрывающейся области другого полинуклеотида указанных по меньшей мере 30000 полинуклеотидов.
32. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, содержащая по меньшей мере 50000 полинуклеотидов.
33. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, в которой каждый полинуклеотид имеет по меньшей мере 25 оснований в длину.
34. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, в которой первая перекрывающаяся область имеет содержание GC от 35 до 65%.
35. Полинуклеотидная библиотека кДНК по п.29, в которой первая перекрывающаяся область имеет от 10 до 100 оснований в длину.