Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и патенты)"
Бюллетень 06´2019

  

(11) 

032513 (13) B1       Разделы: A B C E F G H    

(21) 

201391282

(22) 

2012.03.05

(51) 

C12N 15/10 (2006.01)
C12N 9/10
(2006.01)
C12N 15/01
(2006.01)

(31) 

211583; 217216

(32) 

2011.03.06; 2011.12.27

(33) 

IL

(43) 

2014.04.30

(86) 

PCT/IL2012/000109

(87) 

WO 2012/120500 2012.09.13

(71) 

(73) МЕРК СЕРОНО С.А. (CH)

(72) 

Хельман Дэниел, Бар-Шимон Мейрав, Тойстер-Ачитув Мира (IL)

(74) 

Медведев В.Н. (RU)

(54) 

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ С НИЗКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ФУКОЗЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

(57) 1. Способ получения клеток яичника китайского хомячка CHO-S с нулевым уровнем фукозы, применимых в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантного белка, включающий:

(a) обработку популяции клеток CHO-S метотрексатом (МТХ) в концентрации 100-200 нМ, который вызывает мутацию в гене GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD);

(b) обеспечение контактирования полученной популяции клеток CHO-S, содержащих мутантные клетки, с нетоксичным лектином в течение не более 60 мин, что позволяет осуществить связывание лектина с фукозной группой на клеточной мембране указанных клеток, причем за указанное время не происходит уничтожение клеток; и

(c) выделение субпопуляции клеток, которые связываются с лектином, таким образом отбирая клетки, применимые в качестве клеток-хозяев для экспрессии рекомбинантных белков, где отобранные клетки имеют нулевое содержание фукозы в отсутствие экзогенной фукозы, причем в мутированной GMD отсутствуют аминокислоты, кодируемые экзонами 3 и 4, или аминокислоты, кодируемые экзонами 8 и 9.

2. Способ по п.1, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc-белок.

3. Способ по п.1 или 2, где указанный лектин присоединен к детектируемой группе или аффинной группе.

4. Способ по п.3, в котором при присоединении лектина к аффинной группе дополнительно осуществляют контактирование указанной популяции клеток, содержащей мутантные клетки, с дополнительным агентом, такое дополнительное вещество содержит родственную связывающую группу для указанной аффинной группы.

5. Способ по п.4, где указанная аффинная группа содержит биотин.

6. Способ по п.4, где указанная родственная связывающая группа присоединена к детектируемой группе.

7. Способ по п.6, где указанная детектируемая группа содержит флуоресцентную группу или магнитную частицу.

8. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством FACS сортинга.

9. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют посредством магнитного разделения.

10. Способ по любому из пп.1-4, где указанное выделение осуществляют по меньшей мере тремя циклами последовательного выделения.

11. Способ по любому из пп.1-4, где указанный лектин представляет собой лектин алеврии оранжевой (AAL) или 1-фукоза-специфичный лектин аспергиллы риса (Aspergillus oryzae) (AOL).

12. Выделенная клетка CHO-S, полученная способом по любому из предшествующих пунктов, где клетка является генетически модифицированной для экспрессии мутантной GDP-манноза 4,6-дегидратазы (GMD), имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23 или 24.

13. Выделенная клетка CHO-S по п.12, где величина фукозилирования белка, экспрессированного в ней, линейно зависит от концентрации внешней фукозы, где концентрация внешней фукозы находится между 1 и 10 мкг/мл.

14. Выделенная клетка CHO-S по п.12 или 13, экспрессирующая фукозилтрансферазу-8 (Fut8) дикого типа.

15. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-14, экспрессирующая GDP-кето-6-дезоксиманнозу 3,5-эпимеразу, 4-редуктазу (FX) дикого типа.

16. Выделенная клетка CHO-S по любому из пп.12-15, экспрессирующая рекомбинантное антитело или Fc слитый белок.

17. Клеточная линия CHO-S, содержащая выделенную клетку, полученную способом по п.1.

18. Клеточная линия по п.17, которая образует популяцию клеток, у которой суммарная концентрация жизнеспособных клеток (IVCC) на 20% выше, чем у немутантных клеток CHO-S.

19. Клеточная линия по п.17 или 18, в которой время удвоения популяции не превышает 20 ч.

20. Клеточная линия по любому из пп.17-19, имеющая стабильный фукозный фенотип, по меньшей мере, на протяжении 370 удвоений популяции.

21. Клеточная линия CHO-S по п.20, депонированная в CNCM под номером I-4449.

22. Клеточная культура, которая содержит выделенную клетку CHO-S по п.12 и клеточную культуральную среду, лишенную животных примесей.

23. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда содержит фукозу.

24. Клеточная культура по п.22, где указанная клеточная культуральная среда не содержит фукозу.

25. Способ получения рекомбинантного белка, предусматривающий трансфекцию выделенной клетки CHO-S по п.12 полинуклеотидом, кодирующим рекомбинантный белок, культивирование трансфицированной клетки CHO-S в условиях, подходящих для экспрессии рекомбинантного белка, и выделение указанного белка.

26. Способ по п.25, где рекомбинантный белок представляет собой антитело или Fc слитый белок.

27. Способ по п.25, где указанную трансфекцию проводят в присутствии экзогенной фукозы.

28. Способ по п.25, предусматривающий культивирование выделенной клетки CHO-S по п.12 в культуральной среде, содержащей фукозу, после указанной трансфекции.


наверх