Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и патенты)"
Бюллетень 06´2019

  

(11) 

032482 (13) B1       Разделы: A B C E F G H    

(21) 

201590455

(22) 

2013.08.29

(51) 

C12N 15/09 (2006.01)
C12M 1/00
(2006.01)
C12Q 1/68
(2006.01)

(31) 

2012-190715

(32) 

2012.08.30

(33) 

JP

(43) 

2015.11.30

(86) 

PCT/JP2013/073233

(87) 

WO 2014/034818 2014.03.06

(71) 

(73) КАБУСИКИ КАЙСЯ ДиЭнЭйФОРМ (JP)

(72) 

Хайясизаки Йосихиде, Итох Масаеси, Аракава Такахиро, Усуи Кенго, Уемура Сотаро, Митани Ясумаса (JP)

(74) 

Медведев В.Н. (RU)

(54) 

СПОСОБ АНАЛИЗА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ-МИШЕНИ

(57) 1. Способ анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце, при этом указанный способ включает следующие стадии:

проведение анализа нуклеиновой кислоты-мишени в образце путем приведения образца в контакт с меткой и с праймером, который может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью,

при этом праймер иммобилизован на твердой фазе и является молекулой нуклеиновой кислоты, включающей по меньшей мере одну из структур, представленную формулами (16) и (16b),

метка ковалентно связана с праймером так, что является частью праймера,

метка представляет собой фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, и метка не излучает свет, когда праймер не гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, тогда как если праймер гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, метка излучает свет,

анализ осуществляют путем детекции светового излучения из метки, вызванного гибридизацией праймера с нуклеиновой кислотой-мишенью, и

нуклеиновую кислоту-мишень, которая гибридизована с праймером, удаляют путем промывания, праймер снова гибридизуется с другой нуклеиновой кислотой-мишенью, и снова осуществляют анализ путем детекции светового излучения из метки

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

где в формулах (16) и (16b)

В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила) или остов искусственного основания нуклеиновой кислоты;

Е является:

(i) атомной группой, имеющей остов дезоксирибозы, остов рибозы или структуру, полученную из одного из этих сахаров, или

(ii) атомной группой, имеющей пептидную структуру или пептоидную структуру;

каждый из Z11 и Z12 является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом, и они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;

каждый из L1, L2 и L3 является линкером (соединяющий атом или соединяющая атомная группа), длина их основной цепи (число атомов в основной цепи) является произвольной, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждый из атомов С, N, О, S, Р и Si, каждый из L1, L2 и L3 может содержать или может не содержать в основной цепи каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира, и L1, L2 и L3 могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;

D представляет собой CR, N, Р, Р=O, В или SiR и R является атомом водорода, алкильной группой или произвольным заместителем;

b является одинарной связью, двойной связью или тройной связью;

или, альтернативно,

в формулах (16) и (16b) каждый из L1 и L2 является линкером, L3, D и b могут отсутствовать и L1 и L2 могут быть напрямую связаны с В при условии, что в формуле (16) Е является атомной группой, описанной в подпункте (i), и по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S; и

в формуле (16b) E является атомной группой, описанной в подпункте (ii),

где праймер гибридизуют с нуклеиновой кислотой-мишенью путем приведения праймера в контакт с образцом, тем самым вызывая реакцию амплификации нуклеиновой кислоты-мишени, и

через некоторое время осуществляют анализ нуклеиновой кислоты-мишени путем последующего измерения степени амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в реакции амплификации.

2. Способ по п.1, согласно которому имеются две или более разновидности нуклеиновых кислот-мишеней и соответствующие нуклеиновые кислоты-мишени детектируют раздельно.

3. Способ по п.1 или 2, согласно которому используются две или более разновидностей праймеров.

4. Способ по любому из пп.1-3, согласно которому поверхность твердой фазы, на которой иммобилизован праймер или зонд, является плоской поверхностью, плоской поверхностью чипа, сферической поверхностью или трехмерной поверхностью.

5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому поверхность твердой фазы покрыта покрытием для уменьшения фона.

6. Способ по п.5, согласно которому покрытие для уменьшения фона осуществляется путем прививочной полимеризации.

7. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому в формулах (16) и (16b) длина основной цепи (число атомов основной цепи) каждого из L1, L2 и L3 является целым числом 2 или более.

8. Способ по любому из пп.1-7, согласно которому в формулах (16) и (16b) каждый из Z11 и Z12 независимо представляет собой группу, полученную из любого из следующих красителей: тиазолового оранжевого, оксазолового желтого, цианина, гемицианина, других цианиновых красителей, метилового красного, азокрасителей, биотина, а также их производных.

9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул (7)-(9):

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

где X1 и X2 являются S, О или Se;

n'' является 0 или положительным целым числом;

каждый из R1-R10 и R13-R21 независимо является атомом водорода, атомом галогена, низшей алкильной группой, низшей алкоксигруппой, нитрогруппой или аминогруппой;

один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b), а другой является атомом водорода или низшей алкильной группой;

когда множество R15 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;

когда множество R16 присутствуют в формулах (7), (8) или (9), они могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга;

X1, X2 и R1-R21 в Z11 и X1, X2 и R1-R21 в Z12 могут соответственно быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга.

10. Способ по п.9, согласно которому в формулах (7)-(9) в R1-R21 низшая алкильная группа является линейной или разветвленной алкильной группой с числом атомов углерода от 1 до 6 и низшая алкоксигруппа является линейной или разветвленной алкоксигруппой с числом атомов углерода от 1 до 6.

11. Способ по п.9 или 10, согласно которому в формулах (7)-(9) в R11 и R12 соединяющая группа является полиметиленовой карбонильной группой с числом атомов углерода 2 или более и она связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b) во фрагменте карбонильной группы.

12. Способ по любому из пп.9-11, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной формулой (7) или (8), и Z11 и Z12, представленные формулой (7) или (8), являются группой, представленной следующими формулами (19) или (20):

Увеличить масштаб

где X1, R1-R10, R13 и R14 и R11 и R12 являются идентичными таковым в формулах (7)-(9).

13. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19),

где X1 является S;

R1-R10 являются атомами водорода;

один из R11 и R12 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b), а другой является метильной группой.

14. Способ по п.12, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (19),

где X1 является S;

R1, R4, R5, R6, R7, R9 и R10 являются атомами водорода;

R2, R3 и R12 являются метильными группами;

R8 является атомом галогена;

R11 является соединяющей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b).

15. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной приведенной выше формулой (7),

где X1 является S;

n является 1;

R1-R10, R15, R16 и R17 являются атомами водорода;

R11 является связывающей группой, которая связана с L1 или L2 в формулах (16) и (16b); и

R12 является метильной группой.

16. Способ по п.9, согласно которому каждый из Z11 и Z12 независимо является атомной группой, представленной любой из следующих формул:

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

где в каждой из приведенных выше химических формул n является целым положительным числом.

17. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов природного основания нуклеиновой кислоты (аденина, гуанина, цитозина, тимина или урацила).

18. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой 2-амино-6-(N,N-диметиламино)пурин пиридин-2-он, 5-метилпиридин-2-он, 2-амино-6-(2-тиенил)пурин, пиррол-2-карбальдегид, 9-метилимидазо[(4,5)-b]пиридин, 5-йодо-2-оксо(1Н)пиридин 2-оксо(1Н)пиридин, 2-амино-6-(2-тиазолил)пурин, 7-(2-тиенил)имидазо[4,5-b]пиридин, бромотимин, азааденин или азагуанин.

19. Способ по любому из пп.1-16, согласно которому в формулах (16) и (16b) В является атомной группой, имеющей остов искусственного основания нуклеиновой кислоты, а искусственное основание нуклеиновой кислоты представляет собой Py, Py der., Pu или Pu der., при этом Py является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 1 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 5 в 6-членном кольце, представленном следующей формулой (11):

Увеличить масштаб

Py der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 6-членного кольца Py замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель;

Pu является атомной группой, имеющей ковалентную связь с Е в положении 9 и ковалентную связь с фрагментом линкера в положении 8 в конденсированном кольце, представленном следующей формулой (12):

Увеличить масштаб

и Pu der. является атомной группой, в которой по меньшей мере один из всех атомов 5-членного кольца Pu замещен атомом N, С, S или О и атом N, С, S или О необязательно может иметь электрический заряд, атом водорода или заместитель.

20. Способ по любому из пп.1-19, согласно которому структура, представленная формулой (16), является структурой, представленной следующей формулой (16-1) или (16-2), и структура, представленная формулой (16b), является структурой, представленной следующей формулой (16b-1) или (16b-2):

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

где в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) l, m и n' являются произвольными, l, m и n' могут быть идентичны друг другу или могут отличаться друг от друга, каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать, а может и не содержать каждый из С, N, О, S, Р и Si и каждый из l, m и n' может в своей основной цепи содержать каждую из одинарной связи, двойной связи, тройной связи, амидной связи, сложноэфирной связи, дисульфидной связи, иминогруппы, эфирной связи, связи простого тиоэфира и связи сложного тиоэфира;

В, Е, Z11, Z12 и b являются идентичными таковым в формулах (16) и (16b);

в формулах (16-1) и (16-2) по меньшей мере один атом О в связи фосфорной кислоты может быть замещен атомом S.

21. Способ по п.20, согласно которому в формулах (16-1), (16-2), (16b-1) и (16b-2) каждый из l, m и n' является целым числом 2 или более.

22. Способ по любому из пп.1-6, согласно которому молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере одну из нуклеотидных структур, представленных следующими химическими формулами: 106, 110, 113, 117, 120, 122, 123, 124 и 114-2, их геометрическими изомерами и стереоизомерами, а также их солями:

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

Увеличить масштаб

где n является целым положительным числом.

23. Способ по п.16 или 22, согласно которому длина линкера n заключена в интервале от 2 до 6.

24. Способ по п.1, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени осуществляется методом мостиковой ПЦР.

25. Способ по п.24, согласно которому

в качестве праймера используют пару праймеров,

каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого,

каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,

указанные метки отличаются друг от друга,

в методе мостиковой ПЦР одновременно определяют наличие или отсутствие мутации во множестве локусов в нуклеиновой кислоте-мишени или одновременно анализируют уровни экспрессии множества локусов путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

26. Способ по п.24, согласно которому

в качестве праймера используют пару праймеров,

каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого, каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующими праймерами, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,

указанные метки отличаются друг от друга,

в методе мостиковой ПЦР количественное соотношение мутаций в целом образце, содержащем нуклеиновую кислоту-мишень, определяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

27. Способ по п.24, согласно которому

в качестве праймера используют пару праймеров, каждый из праймеров в указанной паре праймеров включает метку, ковалентно связанную с праймером, и таким образом включает указанную метку как часть его самого,

каждая из меток, ковалентно связанная с соответствующим праймером, является фрагментом флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом,

указанные метки отличаются друг от друга, и в методе мостиковой ПЦР качество образца, содержащего нуклеиновую кислоту-мишень, проверяют путем адаптации меток таким образом, чтобы они не вызывали никакой флуоресценции или вызывали флуоресценцию одного-трех цветов, и осуществляют анализ флуоресцентного цвета; или путем адаптации соответствующих меток таким образом, чтобы вызываемые ими интенсивности флуоресценции отличались друг от друга, и измеряют разницу в интенсивности флуоресценции.

28. Способ по п.23, согласно которому реакция амплификации нуклеиновой кислоты-мишени обусловлена изотермическим методом амплификации.

29. Способ по любому из пп.1-28, согласно которому два или более пятен на праймере иммобилизованы на твердой фазе в произвольном позиционном взаиморасположении.

30. Способ по любому из пп.1-29, согласно которому указанной нуклеиновой кислотой-мишенью является РНК, при этом указанный способ дополнительно включает стадию, вызывающую реакцию обратной транскрипции РНК, и реакция обратной транскрипции вызвана раньше реакции амплификации или в одно и то же время, что и реакция амплификации на твердой фазе, имеющей иммобилизованный на ней праймер.

31. Способ по любому из пп.1-30, согласно которому реакция амплификации вызвана с помощью ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы, обратной транскриптазы (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) или RNA-зависимой РНК-полимеразы.

32. Способ по любому из пп.1-31, согласно которому наличие или отсутствие мутации в нуклеиновой кислоте-мишени обнаруживают путем анализа кривой плавления после реакции амплификации.

33. Способ по любому из пп.1-32, согласно которому анализ кривой плавления осуществляют с помощью зонда, и зонд включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.

34. Способ по п.33, согласно которому используют две или более разновидностей зондов, каждый из которых включает фрагмент флуоресцентного красителя, который характеризуется экситонным эффектом.

Увеличить масштаб


наверх