Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 03´2019

  

(11) 

032036 (13) B1       Разделы: A B C E F G H    

(21) 

201401097

(22) 

2013.05.21

(51) 

C12Q 1/04 (2006.01)
C12Q 1/68
(2006.01)
G01N 33/483
(2006.01)
G01N 33/569
(2006.01)

(31) 

2012 0233

(32) 

2012.06.18

(33) 

UZ

(43) 

2015.04.30

(86) 

PCT/UZ2013/000001

(87) 

WO 2013/192636 2013.12.27

(71) 

(73) МКРТЧЯН ОВИК ЛЕОНАРДОВИЧ (UZ)

(72) 

Гулямов Нариман (UZ)

(74) 

Русакова Н.В. (KZ)

(54) 

СПОСОБ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ВИРУСОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ЛИМФОТРОПИЗМОМ

(57) 1. Способ оценки жизнеспособности вируса гепатита B (HBV), вируса гепатита C (HCV) или вируса иммунодефицита человека (HIV), обладающих лимфотропными свойствами, в образце плазмы, подвергнутой длительному хранению в заморозке или воздействию антивирусных факторов, включающий исследование указанного образца на наличие РНК или ДНК указанных вирусов путем проведения ПЦР, отличающийся тем, что к исследуемому образцу плазмы добавляют равный объем взвеси лимфоцитов из крови здорового человека, смесь перемешивают, инкубируют при температуре 37°C в течение 6-8 ч, отмывают лимфоциты, выделяют их посредством центрифугирования и разрушают их путем медленного замораживания, после чего посредством центрифугирования удаляют мембраны разрушенных лимфоцитов из смеси, отделяют супернатант с цитоплазмой лимфоцитов и посредством ПЦР определяют в нем наличие или отсутствие РНК или ДНК вируса HBV, HCV или HIV, причем обнаружение вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует о сохранении указанным вирусом жизнеспособности в исследуемом образце плазмы, а отсутствие вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует об инактивации указанного вируса или утрате им жизнеспособности в исследуемом образце плазмы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения взвеси лимфоцитов добавляют 6-8 мл крови здорового человека к 2 мл физиологического раствора с 2-3 каплями гепарина, смесь перемешивают, затем на 2 мл раствора фиколл-верографина наслаивают гепаринизированную кровь, выделяют лимфоциты путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 мин, промывают лимфоциты 2-3 раза физиологическим раствором и повторно центрифугируют в тех же условиях, супернатант удаляют, а осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для отмывания лимфоцитов добавляют к смеси физиологический раствор, перемешивают, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин, супернатант удаляют, повторяют процедуру отмывания 2-3 раза, после чего полученный осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для удаления мембран разрушенных лимфоцитов смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин.

5. Способ обнаружения жизнеспособных вирусов HBV, HCV или HIV, обладающих лимфотропными свойствами, в образце плазмы с концентрацией вирусных частиц, не достигающей порога чувствительности методов ИФА или ПЦР, включающий исследование указанного образца на наличие РНК или ДНК указанных вирусов путем проведения ПЦР, отличающийся тем, что к исследуемому образцу плазмы добавляют равный объем взвеси лимфоцитов из крови здорового человека, смесь перемешивают, инкубируют при температуре 37°C в течение 6-8 ч, отмывают лимфоциты, выделяют их посредством центрифугирования и разрушают их путем медленного замораживания, после чего посредством центрифугирования удаляют мембраны разрушенных лимфоцитов из смеси, отделяют супернатант с цитоплазмой лимфоцитов и посредством ПЦР определяют в нем наличие или отсутствие РНК или ДНК вируса HBV, HCV или HIV, причем обнаружение ранее не детектируемой вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует о наличии указанного жизнеспособного вируса в исследуемом образце плазмы, а отсутствие вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует об отсутствии указанных жизнеспособных вирусов в исследуемом образце плазмы.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что для получения взвеси лимфоцитов добавляют 6-8 мл крови здорового человека к 2 мл физиологического раствора с 2-3 каплями гепарина, смесь перемешивают, затем на 2 мл раствора фиколл-верографина наслаивают гепаринизированную кровь, выделяют лимфоциты путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 мин, промывают лимфоциты 2-3 раза физиологическим раствором и повторно центрифугируют в тех же условиях, супернатант удаляют, а осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что для отмывания лимфоцитов добавляют к смеси физиологический раствор, перемешивают, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин, супернатант удаляют, повторяют процедуру отмывания 2-3 раза, после чего полученный осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором.

8. Способ по п.5, отличающийся тем, что для удаления мембран разрушенных лимфоцитов смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин.

9. Способ исключения ложноотрицательных результатов, полученных методами ИФА и ПЦР при исследовании образца крови на наличие жизнеспособных вирусов HBV, HCV или HIV, обладающих лимфотропными свойствами, включающий исследование указанного образца на наличие РНК или ДНК указанных вирусов путем проведения ПЦР, отличающийся тем, что к 2 мл физиологического раствора с 2-3 каплями гепарина добавляют 6-8 мл исследуемого образца крови, смесь перемешивают, затем на 2 мл раствора фиколл-верографина наслаивают гепаринизированную кровь, выделяют лимфоциты путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 20 мин, промывают лимфоциты 2-3 раза физиологическим раствором и повторно центрифугируют в тех же условиях, супернатант удаляют, а осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором, затем полученные лимфоциты разрушают путем медленного замораживания, после чего посредством центрифугирования удаляют мембраны разрушенных лимфоцитов из смеси, отделяют супернатант с цитоплазмой лимфоцитов и посредством ПЦР определяют в нем наличие или отсутствие РНК или ДНК вируса HBV, HCV или HIV, причем обнаружение вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует о наличии указанного жизнеспособного вируса в исследуемом образце крови, а отсутствие вирусной РНК или ДНК в цитоплазме лимфоцитов свидетельствует об отсутствии указанных жизнеспособных вирусов в исследуемом образце крови.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что для отмывания лимфоцитов добавляют к смеси физиологический раствор, перемешивают, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин, супернатант удаляют, повторяют процедуру отмывания 2-3 раза, после чего полученный осадок, содержащий взвесь лимфоцитов, разбавляют физиологическим раствором.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что для удаления мембран разрушенных лимфоцитов смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин.


наверх