Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и патенты)"
Бюллетень 11´2017

  

(11) 

028467 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

201492266

(22) 

2013.06.06

(51) 

C12Q 1/18 (2006.01)

(31) 

00785/12

(32) 

2012.06.06

(33) 

CH

(43) 

2015.05.29

(86) 

PCT/EP2013/061719

(87) 

WO 2013/182647 2013.12.12

(71) 

(73) ИДМИК СА (CH)

(72) 

Говорун Вадим, Илина Елена (RU), Подоплелов Алексей (CH)

(74) 

Осипов К.В., Ильмер Е.Г., Пантелеев А.С., Хмара М.В., Дощечкина В.В., Новоселова С.В., Липатова И.И., Рыбаков В.М. (RU)

(54) 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ХИМИЧЕСКИМ АГЕНТАМ

(57) 1. Способ определения чувствительности микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам, включающий:

(а) добавление микробных клеток к жидкой питательной среде;

(б) воздействие на микробные клетки физического или химического стимула, способного вызывать стрессовую реакцию;

(в) преинкубирование микробных клеток в питательной среде;

(г) добавление к жидкой питательной среде химического агента или антибиотика;

(д) инкубирование микробных клеток;

(е) удаление микробных клеток из инкубационной питательной среды и сбор супернатанта;

(ж) экстракция белков из супернатанта с помощью спирта;

(з) выделение экстрагированного белка из супернатанта, обработанного спиртом;

(и) добавление к экстракту белка растворителя для растворения экстракта белка для масс-спектрометрического анализа;

(к) нанесение растворенного белка вместе с растворителем для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра, высушивание смеси растворенного белка и растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложке с получением образца для масс-спектрометрии;

(л) получение масс-спектра образца для масс-спектрометрии;

(м) сравнение полученного масс-спектра по крайней мере с одним стандартным масс-спектром того же самого микроорганизма для определения чувствительности указанного микроорганизма к химическим агентам или антибиотикам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является химическим стимулом и этап (б) включает добавление к жидкой питательной среде количества химического стимула, специфичного для группы микроорганизмов.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (а) включает добавление примерно 10 колоний микробных клеток к 1 мл жидкой питательной среды.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды используется среда Мюллера-Хинтона.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что мутность жидкой питательной среды, в которой распределены микробные клетки, составляет 0,5 по стандарту МакФарланда, что соответствует приблизительно 1,5´108 колониеобразующих единиц/мл.

6. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют водорастворимую соль яблочной кислоты или аскорбиновой кислоты.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (в) включает преинкубацию микробных клеток в питательной среде в течение 30 мин.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (г) состоит из добавления в пробирку со средой количества антибиотика, равного пороговому уровню для данного микроорганизма, согласно данным Института клинических и лабораторных стандартов.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (д) включает инкубирование микробных клеток в течение 60 мин.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (е) включает удаление микроорганизмов центрифугированием на 10000´g или 15000´g в течение 5 мин при комнатной температуре и сбор супернатанта.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (ж) в качестве спирта используют этанол, и тем, что на этапе (ж) 400 мкл супернатанта смешивают с 900 мкл этанола, имеющего температуру -20°C, и полученную смесь инкубируют при -20°C в течение 1 ч и центрифугируют на 15000´g в течение 20 мин.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что на этапе (и) экстракт белка промывают 70% этанолом, промытый белок растворяют в 5 мкл 70% муравьиной кислоты, к растворенному белку добавляют 5 мкл ацетонитрила, а затем центрифугируют на 15000´g в течение 2 мин.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (к) включает нанесение 1 мкл растворенного белка и 1 мкл растворителя для масс-спектрометрического анализа на подложку масс-спектрометра.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что растворитель для масс-спектрометрического анализа представляет собой насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, растворенной в водном растворе 50% ацетонитрила и 2,5% трифторуксусной кислоты.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что этап (л) включает получение масс-спектра в диапазоне 2000-20000 m/z с использованием времяпролетного масс-спектрометра MALDI в линейном режиме.

16. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на этапе (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют 5 мкл 25 мМ раствора малата натрия.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что стимул, способный вызывать стрессовую реакцию, является физическим стимулом, выбранным из электрического поля, магнитного поля, изменения температуры или дозы радиоактивного облучения.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (ж) спирт имеет температуру -20°C.

19. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что на стадии (б) в качестве химического стимула для бактерий семейства Enterobacteriaceae используют малат натрия или аскорбат натрия.

20. Способ по п.17, отличающийся тем, что стимулом, вызывающим стрессовую реакцию, является изменение температуры.

Увеличить масштаб


наверх