Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и патенты)"
Бюллетень 11´2017

  

(11) 

028326 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

201391402

(22) 

2012.03.29

(51) 

C07K 1/16 (2006.01)

(31) 

61/468,814

(32) 

2011.03.29

(33) 

US

(43) 

2014.01.30

(86) 

PCT/US2012/031076

(87) 

WO 2012/135415 2012.10.04

(71) 

(73) ГЛЭКСОСМИТКЛАЙН ЭлЭлСи (US)

(72) 

Гоклин Кент И., Суда Эрик Дж., Убиера Антонио Рауль (US)

(74) 

Медведев В.Н. (RU)

(54) 

МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ БУФЕРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБЫ ОЧИСТКИ БЕЛКА

(57) 1. Многокомпонентная буферная система для очистки рекомбинантного белка посредством последовательности хроматографических стадий, включающих аффинную хроматографию, и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит:

(а) органическую кислоту,

(b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и

(с) органическое основание, при этом буферная система не содержит NaCl.

2. Система по п.1, где для аффинной хроматографии используют суперантиген, иммобилизованный на твердой фазе.

3. Система по п.2, где суперантиген выбирают из группы, состоящей из белка А, белка G и белка L.

4. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическую кислоту выбирают из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты, лимонной кислоты, яблочной кислоты, малеиновой кислоты, глицина, глицилглицина, янтарной кислоты, TES (2- {[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновой кислоты), MOPS (3-(N-морфолино)пропансуль­фоновой кислоты), PIPES (пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновой кислоты)) и MES (2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты).

5. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание выбирают из группы, состоящей из основания Трис, бис-Трис, бис-Трис-пропана, бицина (N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)ме­тил]амино}пропансульфоновой кислоты) и трицина (N-трис(гидроксиметил)метилглицина).

6. Система по любому из предшествующих пунктов, где соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой, представляет собой соль натрия, калия или аммония и основания, сопряженного с органической кислотой.

7. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту.

8. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическое основание представляет собой основание Трис.

9. Система по любому из предшествующих пунктов, где органическая кислота представляет собой уксусную кислоту и основание, сопряженное с уксусной кислотой, представляет собой соль натрия.

10. Система по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантный белок представляет собой антигенсвязывающий белок.

11. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой антитело класса IgG.

12. Система по п.10, где антигенсвязывающий белок представляет собой один вариабельный домен иммуноглобулина.

13. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий дополнительно включает анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и/или смешанную хроматографию.

14. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает:

(а) хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию или

(b) хроматографию на белке А, проточную анионообменную хроматографию и катионообменную хроматографию.

15. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.

16. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и проточную анионообменную хроматографию в присутствии 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5.

17. Система по любому из предшествующих пунктов, где последовательность хроматографических стадий включает хроматографию на белке А и катионообменную хроматографию в присутствии 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0.

18. Способ очистки белка от его контаминированного раствора с использованием многокомпонентной буферной системы в последовательности хроматографических стадий, где хроматографические стадии включают аффинную хроматографию и где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферной системы или в режиме связывания-элюирования или в проточном режиме, где многокомпонентная буферная система содержит:

(а) органическую кислоту,

(b) соль щелочного металла или соль аммония и основания, сопряженного с органической кислотой (а), и

(с) органическое основание;

где хроматографические стадии осуществляют с использованием буферов, которые получают без добавления NaCl.

19. Способ по п.18, где последовательность хроматогрофических стадий дополнительно включает одно или комбинацию из анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии и смешанной хроматографии.

20. Способ по п.18, в котором стадия аффинной хроматографии представляет собой хроматографию на белке А, которая включает:

(а) уравновешивание белка А, иммобилизованного на твердой фазе, уравновешивающим буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5;

(b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на белке А, иммобилизованном на твердой фазе;

(с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5; и

(d) выделение белка из твердой фазы элюирующим буфером для белка А, который содержит 1,8 мМ ацетата натрия, 28,2 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 3,6, где все буферы получают без добавления NaCl.

21. Способ по п.20, который дополнительно включает следующую стадию после стадии (с) и перед стадией (d): удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы вторым промывочным буфером для белка А, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5, где второй промывочный буфер для белка А получают без добавления NaCl.

22. Способ по п.20 или 21, который дополнительно включает следующие стадии после стадии (d):

(e) титрование раствора, который содержит выделенный белок, приблизительно до рН 3,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl;

(f) предоставление раствору со стадии (е) возможности оставаться при рН приблизительно 3,0 в течение приблизительно от 30 приблизительно до 60 мин и

(g) корректировку рН раствора со стадии (f) приблизительно до рН 7,5 с использованием 1 М Трис.

23. Способ по п.22, который дополнительно включает фильтрование раствора, полученного посредством стадии (g) по п.18.

24. Способ по п.22 или 23 для очистки белка от раствора полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23 посредством проточной анионообменной хроматографии, который содержит:

(а) уравновешивание анионообменной матрицы анионным уравновешивающим буфером, который содержит 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 7,5;

(b) нанесение контаминированного раствора на анионообменную матрицу и сбор первого элюата и

(с) нанесение анионного промывочного буфера, содержащего 55 мМ основания Трис, 45 мМ уксусной кислоты, 300 мМ ацетата натрия, при рН приблизительно 7,5, на анионообменную матрицу и сбор второго элюата, где все буферы получают без добавления NaCl.

25. Способ по п.24, где первый элюат и второй элюат комбинируют в один объединенный проточный раствор.

26. Способ по п.24 или 25, где рН первого элюата, второго элюата и одного объединенного проточного раствора корректируют приблизительно до рН 5,0 30 мМ уксусной кислотой, 100 мМ HCl.

27. Способ по любому из пп.22-26 для очистки белка от контаминированного раствора, выбранного из раствора, полученного посредством стадии (g) по п.22 или фильтрованного раствора по п.23, первого или второго элюата по п.24, одного проточного объединенного раствора по п.25 и элюата со скорректированным рН, полученного по п.26, посредством катионообменной хроматографии, который содержит:

(а) уравновешивание катионообменной матрицы катионным уравновешивающим буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0;

(b) адсорбирование белка из контаминированного раствора на катионообменной матрице;

(с) удаление контаминантов посредством промывания твердой фазы первым катионным промывочным буфером, который содержит 25 мМ ацетата натрия, 12,1 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0 и

(d) выделение белка из твердой фазы с использованием катионного элюирующего буфера, который содержит 175 мМ ацетата натрия, 75 мМ уксусной кислоты, при рН приблизительно 5,0, где все буферы получают без добавления NaCl.


наверх