Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 01´2017

  

(11) 

025738 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

201300190

(22) 

2011.07.29

(51) 

A61K 47/48 (2006.01)

(31) 

61/369,186

(32) 

2010.07.30

(33) 

US

(43) 

2013.07.30

(86) 

PCT/US2011/045873

(87) 

WO 2012/016131 2012.02.02

(71) 

(73) БАКСАЛТА ИНКОРПОРЕЙТИД (US); БАКСАЛТА ГМБХ (CH)

(72) 

Зикманн Юрген, Хайдер Штефан, Роттенштайнер Ханспетер (AT), Ивенс Андреас (CH), Турецек Петер, Цехлинг Оливер (AT)

(74) 

Медведев В.Н. (RU)

(54) 

CПОСОБ КОНЪЮГИРОВАНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИМЕРА С ТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ БЕЛКОМ (ВАРИАНТЫ) И ПОЛУЧЕННЫЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ БЕЛОК (ВАРИАНТЫ)

(57) 1. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, позволяющих конъюгацию;

указанный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МРС);

указанный углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из периодата натрия (NaIO4), тетраацетата свинца (Pb(OAc)4) и перрутената калия (KRuO4);

причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;

при этом образование оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, таким как м-толуидин.

2. Способ конъюгирования водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка, включающий контактирование окисленного углеводного фрагмента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые позволяют конъюгацию;

упомянутый терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia);

упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);

упомянутый углеводный фрагмент окисляется путем инкубирования в буфере, содержащем окислитель, выбранный из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);

причем между окисленным углеводным фрагментом и активной аминооксигруппой на водорастворимом полимере формируется оксимная связь;

причем образование упомянутой оксимной связи катализируется нуклеофильным катализатором, который представляет собой м-толуидин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что величина рН раствора, содержащего исходную концентрацию терапевтического белка от 0,3 до 3,0 мг/мл, доводится до величины от 5,0 до 8,0 перед контактированием с активированным водорастворимым полимером.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка равна 1,0 мг/мл, а рН равен 6,0.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтический белок контактирует с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, причем избыточная концентрация составляет от 1- до 300-молярного избытка.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что избыточная концентрация равна 50-кратному молярному избытку.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что условия включают период времени 120 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

9. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация нуклеофильного катализатора составила от 1,0 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что итоговая концентрация нуклеофильного катализатора равна 10 мМ, а условия включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

11. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислитель добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация окислителя составила от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что итоговая концентрация окислителя равна 400 мкМ, а условия включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

13. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгацию водорастворимого полимера с окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, натрия метабисульфита (Na2S2O5), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется в таком количестве, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гасителем является L-цистеин.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что L-цистеин добавляют до итоговой концентрации 10 мМ, а условия включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и наличие перемешивания.

16. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает:

а) первый этап, включающий корректировку величины рН раствора, содержащего терапевтический белок, до уровня рН от 5,0 до 8,0, при этом концентрация терапевтического белка составляет от 0,3 до 3,0 мг/мл;

б) второй этап, включающий окисление одного или более углеводных фрагментов в терапевтическом белке, при этом окислитель добавляют к раствору, полученному на первом этапе, до итоговой концентрации от 50 до 1000 мкМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

в) третий этап, включающий контактирование терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером в желаемой избыточной концентрации, при этом избыточная концентрация составляет от 1-молярного избытка до 300-молярного избытка, в условиях, включающих период времени от 0,5 до 24 ч, температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

г) четвертый этап, включающий добавление нуклеофильного катализатора к раствору, полученному на третьем этапе, при этом нуклеофильный катализатор добавляют в таком количестве, чтобы итоговая концентрация составила от 1 до 50 мМ, в условиях, которые включают период времени от 0,1 до 30 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

д) пятый этап, на котором терапевтический белок инкубируют с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором, в условиях, позволяющих конъюгацию активированного водорастворимого полимера с одним или более окисленными углеводными фрагментами терапевтического белка, в условиях, которые включают период времени от 0,5 до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

е) шестой этап, на котором конъюгацию водорастворимого полимера с одним или более окисленных углеводных фрагментов терапевтического белка, начатую на пятом этапе, останавливают путем добавления гасителя, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, метионина, глутатиона, глицерина, Na2S2O5 (натрия метабисульфита), триптофана, тирозина, гистидина или его производных, крезола, имидазола и их комбинаций; при этом гаситель добавляется, чтобы итоговая концентрация гасителя составила от 1 до 100 мМ, в условиях, которые включают период времени от 5 до 120 мин; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что исходная концентрация терапевтического белка на первом этапе равна 1 мг/мл, а рН равен 6,0;

при этом итоговая концентрация окислителя на втором этапе равна 400 мкМ, а условия на пятом этапе включают период времени 10 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;

при этом избыточная концентрация на третьем этапе составляет 50 молярных избытков; при этом условия на третьем этапе включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;

при этом итоговая концентрация нуклеофильного катализатора на четвертом этапе равна 10 мМ, а условия на четвертом этапе включают период времени 15 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание;

при этом условия инкубирования терапевтического белка с активированным водорастворимым полимером и нуклеофильным катализатором на пятом этапе включают период времени 2 ч; температуру 22°С; отсутствие света и перемешивание;

при этом гасителем на шестом этапе выступает L-цистеин; при этом L-цистеин добавляется до итоговой концентрации в 10 мМ, а условия на шестом этапе включают период времени 60 мин, температуру 22°С, отсутствие света и перемешивание.

18. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

19. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПЭГ.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК содержит 10-300 единиц сиаловой кислоты.

21. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-IX.

22. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIIa.

23. Способ по п.2, отличающийся тем, что терапевтическим белком является Ф-VIII.

24. Способ по п.2, отличающийся тем, что окислителем является натрия периодат (NaIO4).

25. Способ по п.23, отличающийся тем, что окисленный углеводный фрагмент терапевтического белка расположен в активационном пептиде белка системы свертывания крови.

26. Способ по п.18, отличающийся тем, что ПСК подготавливают путем взаимодействия активированного аминооксисшивающего агента с окисленной ПСК;

при этом аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из:

а) сшивающего агента 3-оксопентан-1,5-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

при этом ПСК окислена путем инкубирования с окислителем для образования терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце ПСК.

27. Способ по п.26, отличающийся тем, что в качестве аминооксисшивающего агента используют 3-оксапентан-1,5-диоксиамин.

28. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве окислителя используют NaIO4.

29. Способ по п.2, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор вводится в концентрации 1-50 мМ.

30. Способ по п.2, отличающийся тем, что м-толуидин находится при реакции конъюгирования в концентрации 10 мМ.

31. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап восстановления оксимной связи в конъюгированном терапевтическом белке путем инкубирования конъюгированного терапевтического белка в буфере, содержащем восстановитель, выбранный из группы, состоящей из цианоборогидрида натрия (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамина С) и NaBH3.

32. Способ по п.31, отличающийся тем, что в качестве восстановителя используют цианоборогидрид натрия (NaCNBH3).

33. Способ по п.2, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап очистки конъюгированного терапевтического белка.

34. Способ по п.33, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищается способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

35. Способ по п.34, отличающийся тем, что хроматография выбрана из группы, состоящей из хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), ионообменной хроматографии (IEC), эксклюзионной хроматографии (SEC), аффинной хроматографии и обратно-фазовой хроматографии.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что на хроматографическом этапе загрузки и хроматографическом этапе промывания используют антихаотропическую соль.

37. Способ по п.35, отличающийся тем, что хроматографию выполняют в колонке.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что в колонке содержится хроматографическая смола, выбранная из группы, состоящей из фенил-сефарозы FF и бутил-сефарозы FF.

39. Способ по п.38, отличающийся тем, что в колонке находится слой смолы высотой от 5 до 20 см.

40. Способ по п.39, отличающийся тем, что высота слоя составляет 10 см.

41. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов отмывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин.

42. Способ по п.41, отличающийся тем, что скорость потока составляет 2 см/мин.

43. Способ по п.37, отличающийся тем, что содержит один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и при которых скорость потока составляет от 0,1 до 6,7 см/мин.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что скорость потока составляет 1 см/мин.

45. Способ по п.33, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

46. Способ по п.33, отличающийся тем, что итоговая концентрация терапевтического белка составляет от 0,5 до 3 мг/мл.

47. Способ по п.33, отличающийся тем, что терапевтический белок включает 5-11 фрагментов водорастворимого полимера.

48. Способ по п.2, отличающийся тем, что конъюгированный терапевтический белок очищают при помощи хроматографии; при этом на этапе загрузки и на этапе промывки используют антихаотропическую соль; при этом способ включает один или более этапов промывания, при которых поток направляется вверх и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин, и один или более этапов элюирования, при которых поток направляется вниз и скорость потока составляет от 0,2 до 6,7 см/мин; и дополнительно включает концентрирование конъюгированного терапевтического белка ультра/диафильтрацией (УФ/ДФ).

49. Способ по п.48, отличающийся тем, что хроматография является хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC); при этом скорость потока на одном или более этапов промывки равна 2 см/мин; и при этом скорость потока на одном или более этапов элюирования равна 1 см/мин.

50. Модифицированный терапевтический белок, получаемый способом по п.2.

51. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы:

а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);

б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи;

при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоил­морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);

при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

52. Способ формирования оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, включающий этапы:

а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);

б) формирование оксимной связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную аминооксигруппу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой оксимной связи;

при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia);

при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоил­морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);

при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

53. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы:

а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);

б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи;

при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоил­морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);

при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

54. Способ формирования гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, включающий этапы:

а) окисление углеводного фрагмента терапевтического белка путем инкубирования упомянутого белка с окислителем, выбранным из группы, состоящей из натрия периодата (NaIO4), свинца тетраацетата (Pb(OAc)4) и калия перрутената (KRuO4);

б) формирование гидразоновой связи между окисленным углеводным фрагментом терапевтического белка и активированным водорастворимым полимером, содержащим активную гидразидную группу, в присутствии нуклеофильного катализатора в условиях, позволяющих образование упомянутой гидразоновой связи;

при этом терапевтический белок выбирают из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia);

при этом упомянутый водорастворимый полимер, содержащий активную гидразидную группу, выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углевода, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дераматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакролоилморфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтиленгидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилметиламмонийфосфата (МФС);

при этом нуклеофильный катализатор представляет собой м-толуидин.

55. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:

а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света, при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;

б) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

56. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:

а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;

б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

57. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:

а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;

б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

в) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

58. Способ по п.2, отличающийся тем, что водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, изготавливают способом, включающим:

а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с активированным аминооксилинкером, включающим активную аминооксигруппу, в условиях, позволяющих образование стабильной оксимной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него; с формированием водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу;

б) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе а), с нуклеофильным катализатором в условиях, которые включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

в) инкубирование раствора, содержащего водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, введенную на этапе б), с восстанавливающим агентом в условиях, позволяющих образование стабильной алкоксаминной связи между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминооксилинкером, упомянутые условия включают период времени от 1 мин до 24 ч; температуру от 2 до 37°С; при наличии или в отсутствие света и при перемешивании или без него;

г) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации и осаждения.

59. Способ по п.55, отличающийся тем, что окисленный водорастворимый полимер выбирают из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), разветвленного ПЭГ, биополимера с низкой вязкостью на основе полиэтиленгликоля PolyPEG®, полисиаловой кислоты (ПСК), углеводов, полисахаридов, пуллулана, хитозана, гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, декстрана, карбоксиметил-декстрана, полиалкиленоксида (ПАО), полиалкиленгликоля (ПАГ), полиоксазолина, полиакрилоил­морфолина, поливинилового спирта (ПВС), поликарбоксилата, поливинилпирролидона, полифосфазена, полиоксазолина, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, сополимера стирола с малеиновым ангидридом, поли(1-гидроксиметилэтилен гидроксиметилформаля) (ПГФ), 2-метакрилоилокси-2'-этилтриметиламмонийфосфата (МФС), при этом упомянутый водорастворимый полимер окисляется путем инкубирования с окислителем с образованием терминальной альдегидной группы на невосстанавливающем конце водорастворимого полимера.

60. Способ по п.59, отличающийся тем, что водорастворимым полимером является ПСК.

61. Способ по п.59, отличающийся тем, что окислителем является NaIO4.

62. Способ по п.55, отличающийся тем, что аминооксисшивающий агент выбирают из группы, состоящей из:

а) сшивающего агента 3-оксапентан-1,5-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

б) сшивающего агента 3,6,9-триокса-ундекан-1,11-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

в) сшивающего агента 3,6,9,12,15-пентаокса-гептадекан-1,17-диоксиамина формулы

Увеличить масштаб

63. Способ по п.56, отличающийся тем, что восстановитель выбирают из группы, состоящей из натрия цианоборогидрида (NaCNBH3), аскорбиновой кислоты (витамин С) и NaBH3.

64. Способ по п.63, отличающийся тем, что восстановителем является натрия цианоборогидрид (NaCNBH3).

65. Способ по п.57, отличающийся тем, что нуклеофильный катализатор добавляется в таком количестве, чтобы дать итоговую концентрацию от 1,0 до 50 мМ нуклеофильного катализатора.

66. Способ по п.55, отличающийся тем, что дополнительно содержит концентрирование конъюгированного терапевтического белка способом ультра/диафильтрации (УФ/ДФ).

67. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по п.1, где терапевтический белок выбран из группы, состоящей из фактора IX, фактора VIII, фактора VIIa, ангиопоэтина, фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактора роста эпидермиса, фактора роста нервов, гормона роста человека, фактора некроза опухолей, инсулина, интерферона (IFN-альфа, IFN-гамма), гранулоцит-колониеобразующего фактора (G-CSF), адалимумаба (Humira) и денозумаба (Prolia).

68. Модифицированный терапевтический белок по п.67, где белок выбран из группы, состоящей из фактора ФVIIa, фактора ФVIII и фактора FIX, и где водорастворимый полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полисалициловой кислоты (ПСК).


наверх