Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 01´2017

  

(11) 

025532 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

201000425

(22) 

2008.10.03

(51) 

C12N 5/00 (2006.01)

(31) 

103843

(32) 

2007.10.04

(33) 

PT

(43) 

2010.10.29

(86) 

PCT/IB2008/054067

(87) 

WO 2009/044379 2009.04.09

(71) 

(73) ЛАБОРАТОРИО МЕДИНФАР-ПРОДУТОС ФАРМАСЕУТИКОС, С.А. (PT)

(72) 

Ганшаш Соарес Рита Изабел, Баптиста Коэльо Мария Констанса, Силва Сантош Жоржи Мигел, Мартинш Жозе Пауло, Басто Вера Александра, Эстилита Монтейро Да Круз Педро, Соареш Да Круз Эльдер Жуаким (PT)

(74) 

Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)

(54) 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ИЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПУПОВИНЫ

(57) 1. Способ выделения клеток-предшественников из ткани человеческой пуповины, включающий стадии, на которых:

а) берут часть пуповины, из которой была удалена амниотическая мембрана, где эта часть пуповины была поперечно разделена, но не подвергалась механическому манипулированию, и не содержит сгустков крови;

б) расщепляют указанную часть пуповины с помощью раствора для ферментативного расщепления, содержащего коллагеназу и трипсин, в первой колбе в условиях, достаточных для высвобождения только указанных клеток-предшественников из указанной части пуповины, то есть при рН 6,4 или выше в течение 2-16 ч при перемешивании с получением раствора, содержащего высвобожденные клетки-предшественники; и затем

в) собирают клетки-предшественники в трех фазах выделения, где

первая фаза выделения включает статичное выдерживание указанной первой колбы, в которую помещен раствор, содержащий высвобожденные клетки-предшественники, в течение периода времени по меньшей мере от 5 до 300 мин после указанной стадии расщепления для облегчения прикрепления первой группы клеток-предшественников к указанной первой колбе; последующее удаление оставшегося раствора, содержащего неприкрепившиеся высвобожденные клетки-предшественники, из указанной первой колбы; последующее размножение указанной первой группы клеток-предшественников, прикрепленных к первой колбе, при культивировании в увлажненной атмосфере, содержащей СО2, до достижения максимальной поверхностной конфлюентности; и затем сбор указанной первой группы клеток-предшественников;

вторая фаза выделения включает центрифугирование оставшегося раствора, содержащего неприкрепившиеся высвобожденные клетки-предшественники, удаленного из указанной первой колбы, с образованием надосадочной жидкости и осадка, содержащих подлежащие выделению клетки; последующее перемещение указанной надосадочной жидкости во вторую колбу, которая является статичной для облегчения прилипания второй группы клеток-предшественников к указанной второй колбе; последующее размножение указанной второй группы клеток-предшественников, прикрепленных ко второй колбе, при культивировании в увлажненной атмосфере, содержащей СО2, до достижения максимальной поверхностной конфлюентности; и затем сбор указанной второй группы клеток-предшественников; и

третья фаза выделения включает сбор третьей группы клеток-предшественников из указанного осадка;

причем на всех трех фазах выделения получают клетки-предшественники, которые могут подвергаться дифференцировке в остеобласты, хондроциты, адипоциты, кардиомиоциты и нервные клетки.

2. Способ по п.1, где указанная часть пуповины поперечно разделена на фрагменты длиной приблизительно 2,5 см каждый.

3. Способ по любому из пп.1, 2, где указанный раствор для ферментативного расщепления содержит 0,0375-0,075% коллагеназы II (мас./об.) и 0,125% трипсина (мас./об.).

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная колба имеет размеры, обеспечивающие соотношение между массой ткани пуповины (г), площадью поверхности дна указанной первой колбы (см2), объемом указанного раствора для ферментативного расщепления (мл) и общим объемом указанной первой колбы (мл), равное приблизительно 1:2:2:37.

5. Способ по любому из пп.1-4, где перемешивание на стадии расщепления осуществляется со скоростью примерно 100 колебаний×мин-1 в сухой атмосфере.

6. Способ по любому из пп.1-5, где расщепление осуществляют в течение примерно 4 ч.

7. Способ по любому из пп.1-6, где указанную первую группу клеток-предшественников, собранную на первой стадии выделения, перед сбором размножают при культивировании в течение одного цикла размножения и/или культивируют до конфлюентности во время указанного размножения.

8. Способ по любому из пп.1-7, где указанную вторую группу клеток-предшественников, собранную на второй стадии выделения, перед сбором размножают при культивировании в течение одного цикла размножения и/или культивируют до конфлюентности во время указанного размножения.

9. Способ по любому из пп.1-8, где выделяют по меньшей мере 8´105 клеток-предшественников в расчете на грамм взятой пуповины.

10. Способ по любому из пп.1-9, дополнительно включающий стадию криоконсервации указанных выделенных клеток-предшественников.

11. Выделенная популяция клеток-предшественников, полученная из ткани пуповины способом по любому из пп.1-10, где указанные клетки-предшественники сохраняют способность дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, адипоциты, кардиомиоциты и нервные клетки, включая глиальные клетки, а также сохраняют способность дифференцироваться по меньшей мере в один дополнительный тип клеток, выбранный из группы, состоящей из

гладкомышечных клеток, клеток скелетных мышц, теноцитов, фибробластов, клеток волосяных фолликулов, клеток эндокринных желез и клеток эпителия, где клетки эпителия выбраны из группы, состоящей из

эпителиальных клеток конъюнктивы, кожных эпителиальных клеток, эпителиальных клеток роговицы, эпителиальных клеток сетчатки, эпителиальных клеток печени, эпителиальных клеток почки, эпителиальных клеток поджелудочной железы, эпителиальных клеток тонкой кишки, эпителиальных клеток толстой кишки, эпителиальных клеток мочевого пузыря, эпителиальных клеток матки, эпителиальных клеток глотки и эпителиальных клеток гортани.

12. Фармацевтическая или косметическая композиция, содержащая выделенную популяцию клеток-предшественников по п.11 и фармацевтически или косметически приемлемый носитель.

13. Способ лечения патологического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту композиции, содержащей клетки-предшественники, полученные способом по любому из пп.1-10.

14. Способ по п.13, где указанную композицию вводят посредством системного введения.

15. Способ по п.13 или 14, где указанное патологическое состояние представляет собой иммуномодуляторное расстройство или опухоль.


наверх