Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 07´2016

  

(11) 

023764 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

201300999

(22) 

2012.03.07

(51) 

C12N 9/00 (2006.01)
C12N 9/02
(2006.01)
C12P 17/04
(2006.01)
C12N 1/15
(2006.01)
C12N 1/21
(2006.01)
C12N 5/10
(2006.01)

(31) 

2006359

(32) 

2011.03.08

(33) 

NL

(43) 

2014.02.28

(86) 

PCT/NL2012/050141

(87) 

WO 2012/064195 2012.05.18

(71) 

(73) ПЮРАК БИОХЕМ Б.В. (NL)

(72) 

Виркс Ник Йоханнес Петрус, Элинк Схюрман Том Даниель, Кюйпер Сипко Мартен, Рёйссенарс Харалд Йохан (NL)

(74) 

Бадаева Т.Н. (RU)

(54) 

ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННАЯ КЛЕТКА И СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УПОМЯНУТОЙ КЛЕТКИ

(57) 1. Генетически модифицированная клетка, содержащая:

(i) первую последовательность нуклеотидов, кодирующую первый полипептид, содержащий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4; и

(ii) вторую последовательность нуклеотидов, кодирующую второй полипептид, обладающий активностью по превращению 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбоновой кислоты (ГМФ-кислоты),

отличающаяся тем, что упомянутая клетка является генетически модифицированной путем функционального введения, по меньшей мере, первой последовательности нуклеотидов и предпочтительно путем функционального введения как первой, так и второй последовательностей нуклеотидов.

2. Генетически модифицированная клетка по п.1, в которой вторым полипептидом является оксидоредуктаза 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбоновой кислоты, предпочтительно полипептид, имеющий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 5 или 6.

3. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1, 2, в которой первая последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 10.

4. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-3, в которой вторая последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 11 или 12.

5. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-4, содержащая третью последовательность полинуклеотидов, кодирующую третий полипептид, содержащий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25.

6. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-5, в которой третья последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32.

7. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-6, в которой клеткой является прокариотическая клетка, такая как бактериальная клетка или эукариотическая клетка, такая как дрожжевая клетка, грибная клетка, растительная клетка или животная клетка.

8. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-7, в которой клеткой является прокариотическая клетка, предпочтительно бактериальная клетка, отобранная из родов Escherichia, Anabaena, Caulobacter, Gluconobacter, Rhodobacter, Pseudomonas, Paracoccus, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Rhizobium (Sinorhizobium), Bradyrhizobium, Flavobacterium, Klebsiella, Enterobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Methylobacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Zymomonas, Acetobacter, Streptococcus, Bacteroides, Selenomonas, Megasphaera, Burkholderia, Cupriavidus, Ralstonia, Methylobacterium, Methylovorus, Rhodopseudomonas, Acidiphilium, Dinoroseobacter, Agrobacterium, Sulfolobus или Sphingomonas, более предпочтительно отобранная из группы, состоящей из Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus puntis, Bacillus megaterium, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Gluconobacter oxydans, Caulobacter crescentus, Methylobacterium extorquens, Methylobacterium radiotolerans, Methylobacterium nodulans, Rhodobacter sphaeroides, Pseudomonas zeaxanthinifaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas putida S12, Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Staphylococcus carnosus, Streptomyces lividans, Sinorhizobium meliloti, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium radiobacter, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium leguminosarum bv. trifolii, Agrobacterium radiobacter, Cupriavidus basilensis, Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha), Ralstonia pickettii, Burkholderia phytofirmans, Burkholderia phymatum, Burkholderia xenovorans, Burkholderia graminis, Rhodopseudomonas palustris, Acidiphilium cryptum, Dinoroseobacter shibae, Sulfolobus addocaldarius, Sulfolobus islandicus, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii.

9. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-8, в которой клеткой является эукариотическая клетка-хозяин, например клетка млекопитающего, насекомого, растения, гриба или водоросли, такая как клетка млекопитающего, отобранная из клеточных линий яйцеклеток китайского хомячка (СНО), COS, 293, PerC6 или гибридом, клетка насекомого, отобранная из клеток Sf9 или Sf21 или производных от них, предпочтительно эукариотическая клетка, отобранная из грибных или дрожжевых клеток таких видов, как Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces или Yarrowia, с большим предпочтением эукариотических клеток, отобранных из Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Pichia stipitis или Pichia pastoris, или клеток мицелиальных грибов, отобранных из подотдела Eumycota и Oomycota или в качестве варианта видов из родов Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium или Trichoderma, таких как Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus, Talaromyces emersonii, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei или Penicillium chrysogenum.

10. Генетически модифицированная клетка по любому из пп.1-9, в которой первая и вторая последовательности нуклеотидов расположены в одном векторе, необязательно, вектор, кроме того, содержит третью последовательность нуклеотидов.

11. Вектор, содержащий:

(i) первую последовательность нуклеотидов, кодирующую первый полипептид, содержащий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 4; и

(ii) вторую последовательность нуклеотидов, кодирующую второй полипептид, обладающий активностью по превращению 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбоновой кислоты (ГМФ-кислоты).

12. Вектор по п.11, в котором вторым полипептидом является оксидоредуктаза 5-(гидроксиметил)фуранкарбоновой кислоты, предпочтительно полипептид, имеющий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 5 или 6.

13. Вектор по любому из пп.11, 12, в котором первая последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 10.

14. Вектор по любому из пп.11-13, в котором вторая последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 11 или 12.

15. Вектор по любому из пп.11-14, содержащий третью последовательность полинуклеотидов, кодирующую третий полипептид, содержащий последовательность аминокислот, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью аминокислот, соответствующей SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25.

16. Вектор по любому из пп.11-15, в котором третья последовательность полинуклеотидов содержит последовательность нуклеотидов, имеющую по меньшей мере 45%, предпочтительно по меньшей мере 60%, такую как по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, такую как 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% сходства последовательности с последовательностью нуклеотидов, соответствующей SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32.

17. Способ превращения 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбоновой кислоты (ГМФ-кислоты), включающий инкубацию клетки по любому из пп.1-10 в присутствии ГМФ-кислоты в условиях, подходящих для превращения ГМФ-кислоты упомянутой клеткой.

18. Способ по п.17, в котором ГМФ-кислоты образуется in situ из одного или более фурановых предшественников ГМФ-кислоты в условиях, подходящих для превращения упомянутой клеткой одного или более предшественников ГМФ-кислоты.

19. Способ по любому из пп.17, 18, в котором второй полипептид клетки является оксидоредуктазой ГМФ-кислоты и, кроме того, содержащий размещение клетки в условиях, подходящих для превращения ГМФ-кислоты в ФДКК.

20. Способ по любому из пп.17-19, в котором фурановый предшественник выбирают из группы, содержащей 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбальдегид (ГМФ), фуран-2,5-дикарбальдегид (ДКФ), [5-(гидроксиметил)фуран-2-ил]метанол (спирт ГМФ), и предпочтительным является ГМФ.

21. Способ по любому из пп.17-20, в котором фурановый предшественник получают из одного или более сахара-гексозы, предпочтительно один или более сахар-гексозу получают из биомассы лигноцеллюлозы, например, катализируемой кислотой реакцией дегидрирования.

22. Способ по любому из пп.17-21, в котором ФДКК извлекается из реакционной смеси способом, содержащим кислотное осаждение, с последующей холодной кристаллизацией или, как вариант, с последующей экстракцией растворителем.

23. Применение генетически модифицированной клетки по любому из пп.1-10 для биотрансформации нескольких фурановых предшественников в ФДКК.

24. Применение по п.23, в котором число фурановых предшественников выбирают из группы, содержащей 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбальдегид (ГМФ), [5-(гидроксиметил)фуран-2-ил]метанол (спирт ГМФ), 5-(гидроксиметил)фуран-2-карбоновую кислоту (ГМФ-кислоту), фуран-2,5-дикарбальдегид (ДКФ) или 5-формилфуран-2-карбоновую кислоту (ФФК).


наверх