Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 1´2011

  

(11) 

014887 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

200600050

(22) 

2004.06.17

(51) 

C12N 15/82 (2006.01)
C07K 14/62
(2006.01)
A01H 5/00
(2006.01)

(31) 

60/478,818; 60/549,539

(32) 

2003.06.17; 2004.03.04

(33) 

US

(43) 

2006.06.30

(86) 

PCT/CA2004/000896

(87) 

WO 2004/111244 2004.12.23

(71) 

(73) СЕМБАЙОСИЗ ДЖИНЕТИКС ИНК. (CA)

(72) 

Молони Морис М., Бут Джозеф, Кеон Ричард, Найкифорук Кори, Ван Роэйен Гейс (CA)

(74) 

Медведев В.Н., Павловский А.Н. (RU)

(54) 

СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ ИНСУЛИНА В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ИНСУЛИН, И РАСТЕНИЯ, СПОСОБНЫЕ ПРОИЗВОДИТЬ СЕМЕНА, СОДЕРЖАЩИЕ ИНСУЛИН

(57) 1. Способ экспрессии инсулина в семенах растения, включающий:

(a) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор; и

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения и

(c) регенерацию клетки растения в зрелое растение, способное давать семена, экспрессирующие инсулин, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ER) или масляное тельце, и по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин;

(d) получение, по существу, чистого инсулина из указанных семян.

2. Способ по п.1, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую пептид или полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, где указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ER) или масляное тельце.

3. Способ по п.2, в котором указанный пептид, удерживающий полипептид инсулина в ER, выбран из группы, состоящей из KDEL, HDEL, DDEL, ADEL и SDEL.

4. Способ по п.1, где последовательность (ii) дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид.

5. Способ по п.4, в котором указанным сигнальным пептидом является сигнальный пептид, связанный с патогенезом табака (PR-S).

6. Способ по п.5, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO:161.

7. Способ по п.2, в котором указанным полипептидом, удерживающим полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, является белок масляного тельца.

8. Способ по п.7, в котором указанный белок масляного тельца выбран из группы белков масляного тельца, состоящей из олеозина, калеозина и стеролеозина.

9. Способ по п.8, в котором указанные белки имеют последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:156, SEQ ID NO:157 и SEQ ID NO:158, SEQ ID NO:159 и SEQ ID NO:160.

10. Способ по п.2, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую стабилизирующий белок, слитую в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин.

11. Способ по п.10, в котором указанная химерная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид, слитую в рамке считывания с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин.

12. Способ по п.11, в котором указанный сигнальный пептид является сигнальным пептидом, связанным с патогенезом табака (PR-S).

13. Способ по п.12, в котором указанный сигнальный пептид имеет последовательность SEQ ID NO:161.

14. Способ по п.10, в котором стабилизирующий белок обеспечивает объединение полипептида инсулина с масляным тельцем при сборе и измельчении семян.

15. Способ по п.14, в котором указанный стабилизирующий белок представляет собой одноцепочечное антитело со специфичностью к масляному тельцу.

16. Способ по п.10, в котором указанный стабилизирующий белок выбран из группы, состоящей из одноцепочечного антитела со специфичностью к масляному тельцу и В-субъединицы токсина холеры.

17. Способ по п.1, в котором химерную последовательность нуклеиновой кислоты вводят в клетку растения в условиях ядерной геномной интеграции.

18. Способ по п.1, в котором предпочтительным для семян промотором является промотор фазеолина.

19. Способ по любому из пп.1-18, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, выбрана из группы, включающей последовательности, кодирующие человеческий инсулин, свиной инсулин и бычий инсулин.

20. Способ по любому из пп.1-19, в котором последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инсулин, является последовательность, кодирующая мини-инсулин.

21. Способ по любому из пп.1-20, в котором последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, оптимизирована в отношении кодонов растения.

22. Способ получения семян растений, содержащих инсулин, включающий:

(a) получение конструкции химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции в виде функционально связанных компонентов:

(i) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор; и

(ii) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина;

(b) введение конструкции химерной нуклеиновой кислоты в клетку растения;

(c) регенерацию клетки растения в зрелое растение, способное давать семена; и

(d) получение семян из указанного растения, содержащих инсулин, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ER) или масляное тельце, и по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин.

23. Растение, способное производить семена, содержащие инсулин, который экспрессируется последовательностью химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции:

(a) последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор, и

(b) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид инсулина, где указанный полипептид инсулина аккумулируется в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте в клетке растения, причем указанный окруженный мембраной внутриклеточный компартмент представляет собой эндоплазматический ретикулюм (ER) или масляное тельце, и где по меньшей мере 0,1% общего белка семени, присутствующего в семени, представляет собой инсулин.

24. Семя растения по п.23, содержащее последовательность химерной нуклеиновой кислоты, содержащей в 5'-3' направлении транскрипции (a) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит предпочтительный для семян промотор, функционально связанный со (b) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид инсулина, и последовательностью, кодирующей полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте.

25. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инсулин, связанная с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей предпочтительный для семян промотор, и содержащая последовательность, кодирующую полипептид, который способен удерживать полипептид инсулина в окруженном мембраной внутриклеточном компартменте, для использования в способе по любому из пп.2-21.


наверх