Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и патенты)"
Бюллетень 1´2010

  

(11) 

012965 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H    

(21) 

200501890

(22) 

2004.05.27

(51) 

C12N 7/02 (2006.01)
C12N 7/04
(2006.01)
C12N 15/86
(2006.01)

(31) 

60/473,798

(32) 

2003.05.28

(33) 

US

(43) 

2006.06.30

(86) 

PCT/US2004/016680

(87) 

WO 2004/112831 2004.12.29

(71) 

(73) ВИСКОНСИН ЭЛАМНИ РИСЁЧ ФАУНДЭЙШН (US)

(72) 

Каваока Йошихиро (US)

(74) 

Дементьев В.Н. (RU)

(54) 

КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ГРИППА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОГО ВИРУСА И РЕАССОРТАНТНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС ГРИППА

(57) 1. Композиция для получения "6+2" реассортантного рекомбинантного вируса гриппа с высоким титром, содержащая множество векторов вирусов гриппа, включающая:

а) векторы для продуцирования вРНК, включающие вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка NA вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции, и вектор, содержащий промотор, функционально связанный с кДНК белка NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции,

причем кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS содержат последовательности, которые соответствуют последовательностям, кодирующим полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO: 1-6, а кДНК для НА и NA не содержат последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 7 или 8, и векторы по подпункту а) содержат промотор РНК-полимеразы I и последовательность терминации РНК-полимеразы I; и

б) векторы для продуцирования мРНК, включающие вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РА вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РВ1 вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок РВ2 вируса гриппа, или вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок NP вируса гриппа.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что векторы по подпункту б) дополнительно включают вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок НА вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок NA вируса гриппа; вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок M1 вируса гриппа, вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок М2 вируса гриппа, или вектор, содержащий промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим белок NS2 вируса гриппа.

3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа А.

4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой НА типа В.

5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что промотор РНК-полимеразы I представляет собой человеческий промотор РНК-полимеразы I.

6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что все векторы по подпункту б) содержат промотор РНК-полимеразы II.

7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту а) является отдельной плазмидой.

8. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый вектор по подпункту б) является отдельной плазмидой.

9. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что каждый из векторов, приведенных в подпункте б), дополнительно содержит последовательность терминации РНК-транскрипции.

10. Композиция по п.1, дополнительно содержащая вектор, включающий промотор, связанный с 5'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК, соединенной с 3'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.

11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.

12. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.

13. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.

14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что НА представляет собой подтип Н5.

15. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что Н5 НА представляет собой мутантный Н5 с авирулентным сайтом расщепления.

16. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-6 или комплементарным им последовательностям.

17. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом, кодируемым одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-6.

18. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS содержат область, кодирующую полипептид, кодируемый одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-6.

19. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS соответствуют последовательностям SEQ ID NO: 1-6.

20. Способ получения инфекционного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с композицией по п.1 в количестве, эффективном для получения инфекционного вируса гриппа.

21. Способ по п.20, дополнительно включающий выделение вируса.

22. Способ получения переносчика (носителя) для доставки генов, включающий обеспечение контактирования клеток с композицией по п.10 в количестве, эффективном для получения вируса гриппа, который является указанным переносчиком, и выделение вируса.

23. Способ получения "6+2" реассортантного рекомбинантного вируса гриппа, включающий обеспечение контактирования клетки с вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ1 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК РВ2 вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК НА вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NP вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NA вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК М вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования вРНК, содержащим промотор, функционально связанный с кДНК NS вируса гриппа, соединенной с последовательностью терминации транскрипции; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РА вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ1 вируса гриппа; вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим РВ2 вируса гриппа, и вектором для продуцирования мРНК, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NP вируса гриппа, так чтобы получать инфекционный вирус, причем кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS содержат последовательности, кодирующие полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по крайней мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности полипептида, кодируемого одной из SEQ ID NO: 1-6, а кДНК для НА и NA не содержат последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 7 или 8, и векторы для продуцирования вРНК содержат промотор РНК-полимеразы I и последовательность терминации РНК-полимеразы I.

24. Способ по п.23, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим НА вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NA вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим M1 вируса гриппа, вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим М2 вируса гриппа, и вектором, содержащим промотор, функционально связанный с сегментом ДНК, кодирующим NS2 вируса гриппа.

25. Способ по п.23 или 24, дополнительно включающий обеспечение контактирования клеток с вектором, содержащим промотор, функционально связанный с 5'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 5'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с представляющей интерес последовательностью кДНК или ее фрагментом, соединенной (или соединенным) с 3'-концом последовательностей вируса гриппа, содержащих 3'-некодирующие последовательности вируса гриппа, связанные с последовательностью терминации транскрипции.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК включает открытую рамку считывания иммуногенного полипептида, или пептида патогенного организма, или терапевтически активного полипептида, или пептида.

27. Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК находится в смысловой ориентации.

28. Способ по п.25, отличающийся тем, что представляющая интерес кДНК находится в антисмысловой ориентации.

29. Способ по п.23, дополнительно включающий выделение вируса.

30. Способ по п.23, отличающийся тем, что НА представляет собой подтип Н5.

31. Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют нуклеотидные последовательности, по меньшей мере на 90% идентичные последовательностям SEQ ID NO: 1-6 или комплементарным им последовательностям.

32. Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS кодируют полипептид с одной или более консервативных замен по сравнению с соответствующим полипептидом, кодируемым одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-6.

33. Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, М и NS имеют кодирующую область для полипептида, кодируемого одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-6.

34. Способ по п.23, отличающийся тем, что кДНК для РВ1, РВ2, PA, NP, M и NS комплементарны последовательностям SEQ ID NO: 1-6.

35. Выделенный "6+2" реассортантный рекомбинантный вирус гриппа, полученный способом по п.31, содержащий вирусную геномную РНК для Н5 НА, который выращивают в куриных эмбрионах до титра по меньшей мере 1010ED50/мл.

36. Реассортантный вирус гриппа по п.35, отличающийся тем, что Н5 НА представляет собой мутантный Н5.


наверх