Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 2´2007

  

(11)

008254 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H   

(21)

200501773

(22)

2004.05.06

(51)

C07K 14/525 (2006.01)
C12N 15/28
(2006.01)
A61K 38/19
(2006.01)
A61K 48/00
(2006.01)
A61K 39/00
(2006.01)

(31)

PA 2003 00701; 60/469,491

(32)

2003.05.09

(33)

DK; US

(43)

2006.06.30

(86)

PCT/DK2004/000329

(87)

WO 2004/099244 2004.11.18

(71)(73)

ФАРМЕКСА А/С (DK)

(72)

Братт Томас, Клюснер Стеен, Нильсен Финн, Моуритсен Серен, Вольдборг Бьерн (DK)

(74)

Медведев В.Н., Павловский А.Н. (RU)

(54)

ДЕТОКСИФИЦИРОВАННЫЙ TNF И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

(57) 1. Иммуногенный аналог белка TNFa человека, причем указанный аналог содержит:

(a) два или три полных мономера TNFa, соединенных последовательно пептидным линкером, где по меньшей мере один пептидный линкер включает в себя по меньшей мере одну связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность, или

(b) два или три полных мономера TNFa, соединенных последовательно инертным пептидным линкером, где по меньшей мере один из этих мономеров включает в себя по меньшей мере одну чужеродную связывающую МНС Класса II аминокислотную последовательность или где по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность слита с N- или С-концевым мономером, необязательно через инертный линкер, или

(c) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в гибкую петлю 3, или

(d) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, который стабилизирует трехмерную структуру мономера TNFa, или

(e) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором делетирована любая из аминокислот 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9 на аминоконце, или

(f) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в петлю 1 в положении интрона, или

(g) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность введена в виде части искусственного района "ножки" на N-конце TNFa человека, или

(h) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность введена таким образом, чтобы стабилизировать структуру мономера путем увеличения гидрофобности границы тримерного взаимодействия, или

(i) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность, фланкированная остатками глицина, инсертирована или встроена в виде замены в аминокислотную последовательность TNFa, или

(j) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены в петлю D-E, или

(k) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере одна чужеродная связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность инсертирована или встроена в виде замены между двумя идентичными субпоследовательностями TNFa человека, или

(l) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), в котором по меньшей мере один солевой мостик в TNFa человека усилен или заменен дисульфидным мостиком, или

(m) мономер TNFa человека или аналог, определяемый в (а) или (b), где растворимость или стабильность в отношении протеолиза усилена введением мутаций, которые имитируют кристаллическую структуру мышиного TNFa, где потенциальная токсичность уменьшена или устранена введением по меньшей мере одной точковой мутации, выбранной из группы, состоящей из Y87S, D143N или A145R, причем нумерация этих аминокислот устанавливается от N-концевого валина в TNFa человека.

2. Иммуногенный аналог по п.1, где связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность связывает большинство молекул МНС Класса II из вида животного, из которого был получен мультимерный белок.

3. Иммуногенный аналог по п.2, где по меньшей мере одна связывающая МНС Класса II аминокислотная последовательность выбрана из природного Т-клеточного эпитопа и искусственной связывающей MHC-II пептидной последовательности.

4. Иммуногенный аналог по п.3, где природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа CS P. falciparum.

5. Иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, где аминокислотная последовательность аналога выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 и 18 и любой аминокислотной последовательности, которая включает в себя только консервативные замены ее аминокислот.

6. Иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, который может быть экспрессирован в виде растворимого белка из бактериальных клеток.

7. Фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует иммуногенный аналог по любому из предыдущих пунктов, или комплементарный ему фрагмент нуклеиновой кислоты.

8. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.7, который является ДНК-фрагментом.

9. Фрагмент нуклеиновой кислоты по п.7 или 8, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют любую из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 и 18, или комплементарную ей последовательность нуклеиновой кислоты.

10. Способ понижающей регуляции аутологичного TNFa у животного-хозяина, предусматривающий выполнение презентации иммунной системе этого животного иммуногенного количества по меньшей мере одного иммуногенного аналога по любому из пп.1-6.

11. Способ по п.10, в котором аутологичным хозяином является млекопитающее, такое как человек.

12. Способ по п.10 или 11, в котором презентацию выполняют путем введения аутологичному хозяину иммуногенного аналога по любому из пп.1-6, необязательно в смеси с адъювантом.

13. Способ по п.12, в котором адъювант выбран из группы, состоящей из иммунного нацеливающего адъюванта; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин и микобактериальное производное; масляной композиции; полимера; образующего мицеллу адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (матрикса ISCOM); частицы; DDA; содержащих алюминий адъювантов; ДНК-адъювантов; g-инулина и инкапсулирующего адъюванта.

14. Способ по любому из пп.10-13, в котором иммуногенно эффективное количество аналога вводят животному посредством способа, выбранного из парентерального способа, такого как интрадермальный, субдермальный и внутримышечный способы; перитонеального способа; перорального способа; буккального способа; сублингвального способа; эпидурального способа; спинального способа; анального способа и интракраниального способа.

15. Способ по п.14, в котором эффективное количество составляет от 0,5 до 2000 мкг.

16. Способ по п.14 или 15, который предусматривает по меньшей мере одно введение в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.

17. Способ по п.10, в котором презентацию аналога иммунной системе выполняют путем введения нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот), кодирующей этот аналог, в клетки животного и получения посредством этого экспрессии in vivo этими клетками введенной нуклеиновой кислоты (введенных нуклеиновых кислот).

18. Способ по п.17, в котором вводимая нуклеиновая кислота (вводимые нуклеиновые кислоты) выбрана/выбраны из "голой" ДНК, ДНК, составленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК, заключенной в липосомы, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, составленной с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, составленной с нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, составленной с осаждающими кальций агентами, ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитин или хитозан, и ДНК, составленной с адъювантом, таким как адъюванты, определяемые в п.13.

19. Способ по п.17 или 18, в котором эти нуклеиновые кислоты вводят внутриартериально, внутривенно или способами, определяемыми в п.14.

20. Способ по любому из пп.17-19, который предусматривает по меньшей мере одно введение нуклеиновых кислот в год, например по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 6 и по меньшей мере 12 введений в год.

21. Способ по п.10, в котором презентацию иммунной системе выполняют путем введения непатогенного микроорганизма или вируса, который несет фрагмент нуклеиновой кислоты, который кодирует и экспрессирует этот аналог.

22. Способ по п.21, в котором вирусом является невирулентный поксвирус, такой как вирус коровьей оспы.

23. Способ по п.21, в котором микроорганизмом является бактерия.

24. Способ по любому из пп.21-23, в котором непатогенный микроорганизм или вирус вводят животному один-единственный раз.

25. Композиция для индукции продуцирования антител против мультимерного белка, содержащая

иммуногенный аналог по любому из пп.1-6 и

фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.

26. Композиция для индукции продуцирования антител против мультимерного белка, содержащая

фрагмент нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 и

фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант.

27. Композиция по п.25 или 26, в которой аналог составлен, как определено в любом из пп.30 или 31.

28. Способ получения аналога по любому из пп.1-6, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, трансформированной фрагментом нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9, в условиях, которые облегчают его экспрессию, и затем извлечение аналога в виде белкового продукта экспрессии из культуры.

29. Способ по п.28, в котором клеткой-хозяином является бактериальная клетка-хозяин.

30. Способ по п.29, в котором аналогом является растворимый продукт экспрессии.

31. Способ по любому из пп.28-29, в котором клетку-хозяина культивируют при температуре ниже 32°С в течение значительного периода, при котором продукт экспрессии продуцируется клеткой-хозяином.

32. Способ по п.31, где температура составляет приблизительно 25°С.

33. Способ по п.31 или 32, где температуру поддерживают, по существу, постоянной в течение всего периода культивирования клетки-хозяина.


наверх