Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 2´2007

  

(11)

008222 (13) B1       Разделы: A B C D E F G H   

(21)

200500700

(22)

2003.10.22

(51)

C12N 5/10 (2006.01)
C12N 15/85
(2006.01)
C12N 15/63
(2006.01)
C12N 15/64
(2006.01)
C12P 21/00
(2006.01)

(31)

60/421,252

(32)

2002.10.24

(33)

US

(43)

2005.10.27

(86)

PCT/US2003/033433

(87)

WO 2004/037982 2004.05.06

(71)(73)

БАЙОДЖЕН АЙДЕК МА ИНК. (US)

(72)

Прентис Холли (US)

(74)

Медведев В.Н., Павловский А.Н. (RU)

(54)

ВЫСОКОЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ЛОКУСНЫЙ ВЕКТОР, ПОЛУЧЕННЫЙ НА ОСНОВЕ ЛОКУСА ГЕНА ТЯЖЕЛОЙ ЦЕПИ ФЕРРИТИНА

(57) 1. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первый сайт встраивания первой гетерологичной кодирующей последовательности и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)→(d) в ориентации 5'→3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

2. Генетический вектор для стабильной трансфекции и экспрессии нужного белка в эукариотических клетках, включающий:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую гетерологичную последовательность, кодирующую указанный нужный белок; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)→(d) в ориентации 5'→3' посредством необязательных линкерных последовательностей между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

3. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

4. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

5. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности и указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

6. Генетический вектор по любому из пп.1-5, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности происходят от локуса тяжелой цепи ферритина.

7. Генетический вектор по любому из пп.1-6, который дополнительно содержит дистальные 3'-фланкирующие последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

8. Генетический вектор по любому из пп.1 и 3-7, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности включает по меньшей мере один рестриктционный сайт эндонуклеазы.

9. Генетический вектор по п.8, где указанный сайт встраивания гетерологичной последовательности представляет собой полилинкерный сайт, включающий по меньшей мере два рестриктционных сайта эндонуклеазы.

10. Генетический вектор по любому из пп.1-9, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают эукариотическую интронную последовательность.

11. Генетический вектор по п.10, где указанная эукариотическая интронная последовательность происходит от интрона 1 гена тяжелой цепи ферритина.

12. Генетический вектор по любому из пп.1-11, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности включают нетранслируемые экзонные последовательности.

13. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности и указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

14. Генетический вектор по любому из пп.1-12, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности и любые дистальные 3'-фланкирующие последовательности имеют общую длину от 1000 до 10000 нуклеотидов.

15. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

16. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

17. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет 100% идентичность указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

18. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

19. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина.

20. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

21. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

22. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

23. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

24. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

25. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 0, 1, 2 или 3 нуклеотида.

26. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 4 нуклеотида.

27. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 1000 нуклеотидов.

28. Генетический вектор по п.1, где длина указанного первого сайта встраивания составляет 5000 нуклеотидов.

29. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

30. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

31. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

32. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат последовательность, которая на 100% идентична нуклеотидной последовательности проксимальным 3'-регуляторным последовательностям локуса тяжелой цепи ферритина.

33. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 10 нуклеотидов.

34. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат по меньшей мере 1000 нуклеотидов.

35. Генетический вектор по любому из пп.1-2, где указанные проксимальные 3'-регуляторные последовательности содержат сигнал полиаденилирования.

36. Генетический вектор по любому из пп.1-2, дополнительно содержащий дистальную 3'-фланкирующую последовательность эукариотического локуса, включающую последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

37. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

38. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

39. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность включает последовательность, которая на 100% идентична указанной нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

40. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 500 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

41. Генетический вектор по п.36, где указанная дистальная 3'-фланкирующая последовательность содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере 1000 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей в дистальной 3'-фланкирующей последовательности локуса тяжелой цепи ферритина.

42. Генетический вектор pFerX8.

43. Генетический вектор pFerX11.

44. Эукариотическая клетка, трансфицированная вектором по любому из пп.1-43.

45. Эукариотическая клетка по п.44, где указанный вектор устойчиво интегрирован в хромосому указанной клетки.

46. Эукариотическая клетка по любому из пп.44-45, где указанная первая кодирующая последовательность экспрессируется в указанной клетке.

47. Эукариотическая клетка, содержащая:

(a) дистальные 5'-фланкирующие последовательности эукариотического локуса;

(b) проксимальные 5'-регуляторные последовательности эукариотического локуса;

(c) по меньшей мере, первую кодирующую последовательность; и

(d) проксимальные 3'-регуляторные последовательности, эффективные для терминации транскрипции эукариотического локуса;

где указанные последовательности функционально присоединены в порядке (a)→(d) в ориентации 5'→3' посредством необязательных линкерных последовательностей, расположенных между смежными последовательностями; и

где

(1) указанные дистальные 5'-фланкирующие последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 100 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 20-100000 п.н. от сайта инициации транскрипции локуса тяжелой цепи ферритина; или

(2) указанные проксимальные 5'-регуляторные последовательности содержат экзогенную последовательность, которая имеет по меньшей мере 20 нуклеотидов и которая по меньшей мере на 70% идентична нуклеотидной последовательности, присутствующей со стороны 5'-конца на расстоянии 1-10000 п.н. от кодона инициации трансляции локуса тяжелой цепи ферритина.

48. Эукариотическая клетка, содержащая экзогенную дистальную 5'-фланкирующую последовательность, происходящую от локуса тяжелой цепи ферритина и функционально присоединенную к кодирующей последовательности.

49. Способ продуцирования нужного белка в эукариотической клетке, предусматривающий:

(a) продуцирование по меньшей мере одной клетки по любому из пп.44-48 или ее потомства;

(b) поддержание указанной клетки в культуре в условиях, обеспечивающих высокий уровень экспрессии нужного белка; и

(c) выделение указанного нужного белка из указанной культуры.


наверх